路佩瑶，曹宁贤，王福传，宋献艺，闫益波，高 莉，赵英虎，张 凯，张玉换（.山西省农业科学院饲料兽药研究所，太原 000；.山西省畜禽繁育工作站；.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，太原 000；.中北大学化工与环境学院）

成年绵羊不同组织中GPR 30mRNA表达特性研究

路佩瑶1，曹宁贤2，王福传1，宋献艺1，闫益波3，高 莉4，赵英虎4，张 凯1，张玉换3
（1.山西省农业科学院饲料兽药研究所，太原 030031；2.山西省畜禽繁育工作站；3.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，太原 030032；4.中北大学化工与环境学院）

文章旨在研究成年绵羊不同组织中GPR 30mRNA的表达特性。采用qRT-PCR法对成年杂交绵羊不同组织中GPR 30mRNA的表达进行相对定量分析。结果表明：GPR 30mRNA在心脏等其他组织中有少量的表达，在卵巢、附睾尾及下丘脑中显著表达（P＜0.05）。说明GPR 30mRNA在成年绵羊的不同组织中均有不同程度的表达，并在繁殖器官的生长、发育过程中起着重要的作用。

绵羊；GPR 30；卵巢；睾丸；下丘脑

G蛋白偶联受体30（G protein-coupled receptor30）是跨膜的雌激素受体，主要与雌激素结合，发挥重要作用［1-3］。研究表明，GPR 30对于睾丸细胞的增殖及发育具有重要作用［4］。GPR 30作为一种膜受体参与对生殖功能的调节已得到验证［5-9］。2011年，Franco等［10］和Rago等［11］通过免疫组化技术，将GPR 30定位在人类睾丸间质细胞和生精细胞中。2012年，Chevalier等利用过表达技术进一步研究发现，GPR 30在正常人类睾丸支持细胞、精原细胞和精母细胞中表达［12］。体外培养人类精母细胞，Alves等在mRNA水平已经证实GPR 30的存在［13-15］。GPR 30广泛存在于生殖系统的多种组织中，参与了雌激素对仓鼠卵泡发育［16］，斑马鱼卵母细胞成熟［17］，以及小鼠子宫生长的作用［18］。目前，已有对啮齿动物脑内GPR 30分布的研究报道，证实GPR 30在下丘脑中表达［19］。然而目前国内外对于GPR 30的研究主要集中在小鼠、大鼠及人的卵巢、下丘脑和睾丸细胞上，对于绵羊等经济动物的研究未有报道。尤其杂交绵羊不同组织中GPR 30 mRNA的表达特性研究也未见研究。因此，本研究以成年无角陶赛特羊（）×蒙古羊（♀）杂交羊为研究对象，在mRNA水平上研究GPR 30基因的表达特性，为以后的科研工作者和动物生产提供理论基础。同时为进一步了解GPR 30的重要作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及组织

1.2 主要试剂

TrizolReagent（宝生物工程大连有限公司），SYBR誖Premix Ex TaqTMⅡ（宝生物工程大连有限公司），Prime-ScriptTMRTReagent Kit（宝生物工程大连有限公司），pEASY誖-T3 cloning Kit（北京全式金生物技术有限公司），感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），GC-rich PCRMasterMix（北京康为世纪生物有限公司）。其他常用试剂为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取及cDNA合成 取出-80℃保存的成年杂交羊不同组织，按照Trlzol操作说明提取总RNA，核酸蛋白测定仪ND-1000（美国Nano-Drop Technologies）测定总RNA浓度和纯度，RNA浓度调至1μg/L左右，-80℃保存。根据PrimeScript誖RTReagentkit试剂盒操作说明，反转录。10μL反转录体系为：5×Prime Script誖Buffer（for Real Time）2μL，Total RNA 1μL，RNase Free ddH2O 7.0μL；37℃15min，85℃5s。反转录产物-20℃保存。1.3.2引物设计与合成 根据GenBank上的人GPR 30 mRNA序列（登录号：CR541741.1）和绵羊18S rRNA（登录号：AY753190.1），利用Primer Premier5.0软件分别设计特异性引物各1对，由北京华大中生基因有限公司合成，引物序列如表1。

表1 GPR 30及18S引物序列

1.3.3 RT-PCR 15μLPCR反应体系：正反向引物（10 μmol/L）各0.6μL，cDNA模板0.8μL，ddH2O 5.5μL，2× EsTaqMasterMix（含染料）7.5μL。反应条件：94℃3min；94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃5min，产物经3.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.4 测序测定 按照pEASY誖-T3 cloning Kit说明，将回收出的 DNA片段连接至 T3-Cloing-Vector，PCR仪25℃恒温10min，使回收产物与T3载体充分连接。连接产物导入感受态细胞，涂布到LB固体培养基（含AMP），37℃过夜（12～16 h）培养。蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，LB液体培养基（含AMP）培养12～16 h，菌液交由北京华大中生基因有限公司测序。

1.3.5 相对定量标准曲线 将含GPR 30 cDNA片段的模板按照2×稀释8个梯度，制备标准品，分别为：1.0×29、1.0×28、1.0×27、1.0×26、1.0×25、1.0×24、1.0×23、1.0×22。使用ddH2O代替模板，作为阴性对照，荧光定量体系为：SYBR Primix Ex TaqTM10μL，正反向引物各0.8μL，cDNA模板2.0μL，Rox Reference DyeⅡ0.4μL，ddH2O 6.0μL，总体积20μL，反应程序：95℃变性10 s，95℃5 s，60℃25 s，共40个循环。软件自动得出扩增曲线、熔解曲线和循环阈值，分析结果。

1.3.6 qRT-PCR 根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒建议反应条件构建反应体系同上，每个样本重复3次，根据Ct值计算相对表达量。

1.4 数据处理

利用SASV8（The SASSystem for Windows V8）中ANOVA进行方差分析，Duncan法进行多重比较。

2 结果

2.1 总RNA提取及RT-PCR

经检测，不同组织样品的总RNA OD260nm/OD280nm值均在1.8～2.0之间，且3.0%变性琼脂糖凝胶电泳检测28S、18S清晰，符合反转录要求。以成年杂交羊的心、肝等组织的cDNA为模板进行RT-PCR，3.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，无拖尾和引物二聚体，在附睾体和附睾尾中显著表达（如图1）。测序结果BLAST分析显示，GPR 30 cDNA与NCBI公布的人GPR 30 cDNA同源性为：98.48%，说明杂交羊GPR 30 cDNA序列具有较高的保守性，该序列可用于荧光定量检测。

图1 成年绵羊不同组织RT-PCR结果

2.2 相对定量标准曲线的建立

图2-A为标准曲线。结果显示，标准曲线呈良好的线性关系，GPR 30和18S的扩增效率分别为99.7%和99.8%，R2分别为0.995和1.013。杂交绵羊不同组织的GPR 30mRNA荧光定量的扩增动力学曲线平行性良好，起峰点清晰，基线比较平稳，拐点相对清楚，曲线为S型（图2-B）；熔解曲线显示，峰单一，无引物二聚体和非特异性产物出现（图2-C）。表明本试验建立的GPR 30 mRNA定量检测方法满足试验要求。

2.3 杂交羊不同组织中GPR 30mRNA表达量

成年杂交羊不同组织中GPR 30mRNA荧光定量检测结果显示，GPR 30mRNA在心、肝、脾、肾、大脑、小脑、下丘脑中均有不同程度的表达，下丘脑中GPR 30mRNA的表达量显著高于其他组织（P＜0.05）；GPR 30mRNA在附睾体、附睾尾中的表达量显著高于睾丸和附睾头（P＜0.05）；GPR 30mRNA在卵巢中的表达量显著高于子宫（P＜0.05），子宫体、子宫颈、子宫角中GPR 30mRNA的表达量均差异不显著（P＞0.05）。

图2 GPR 30和18S的标准曲线、扩增动力学曲线和熔解曲线

图3 绵羊不同组织中GPR 30mRNA相对表达量

3 讨论

GPR 30在人类多种组织中广泛表达，包括睾丸、卵巢和前列腺［20］。GPR 30介导多种细胞类型，调节机体生理作用，在小鼠的睾丸细胞细胞浆中已证实有GPR 30的表达［21-23］。Otto等发现在小鼠睾丸组织中GPR 30显著表达［24］。本研究发现，在成年杂交羊的心脏等组织中具有不同程度的表达，且在附睾尾、下丘脑及卵巢中显著表达，这与前人的研究结果相符。笔者认为，在附睾尾中大量表达，GPR 30可能与精子的成熟具有重要的关系。

Hazell等［25］证明GPR 30在大鼠卵巢中主要位于卵泡颗粒和膜细胞中；同时GPR 30免疫反应阳性产物也主要定位于细胞的胞膜和胞质中，表明其作为一种膜受体并进入胞内相应部位如内质网和核周区等，进而触发下游的信号途径［26］，进一步验证了本研究中在卵巢中大量表达。推测GPR 30对于卵子的生成及卵巢的生长具有重要作用，其具体机制如何，有待于进一步研究。

Brailoiu等［27］首次全面报道GPR 30免疫反应产物在大鼠中枢神经系统内的分布，发现GPR 30主要位于下丘脑-垂体轴、海马、脑干等部位；GPR 30在下丘脑的室旁核、视上核、视交叉上核、室周核、弓状核以及乳头体外侧核都有明显的表达，而在腹外侧核、乳头体内侧核等处表达明显减少，这与本研究结果基本一致。进一步推测，GPR 30对性激素的分泌具有调节作用。

4 结论

GPR 30mRNA在成年绵羊的不同组织中均有不同程度的表达，推测其在繁殖器官的生长、发育过程中起着重要的作用。

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GPR 30m RNA Expression in D ifferent Tissuesof Adult Sheep

Lu Peiyao1,Cao Ningxian2,Zhang Yuhuan3，etal
（1.Feed and Veterinary DrugResearch Institute,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan 030031,China; 2.Livestock Breeding Station ofShanxiProvince；3.InstituteofAnimalHusbandryand Veterinary Sciences,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan 030032,China）

Theobjectiveof thisstudywas toevaluate GPR 30mRNA expression in different tissuesofadultsheep.GPR 30mRNA expressions in different tissues of adult sheep were detected by real-time fluorescentquantitative PCR.The results showed that GPR 30 mRNA was not significantly expressed in the heart and other organizations.However，GPR 30 mRNA was significantly expressed in the ovary,epididymidis body and hypothalamus（P＜0.05）.GPR 30mRNA appeared to be ubiquitously expressed almostin different tissuesofadultsheep.Itplaysan important role in the sheep reproductiveorgan growth and development.

sheep；GPR 30；ovary；testis；hypothalamus

S826.2

A

2095-3887（2015）04-0013-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.004

2015-06-20

山西省农业科技攻关项目（20130311025-1）;山西省科技攻关项目（20140311008-7）;山西省农业科技攻关项目（20130311025-4）;山西省农业科学院博士基金项目（YBSJJ1403）;山西省青年科技研究基金（2012021027-3）

路佩瑶（1984-），女，助理研究员，博士。

张玉换（1957-），女，研究员，主要从事肉羊健康养殖及疫病防控技术工作。