2-丙基-4-戊烯酸血药浓度与谷丙转氨酶的关系*

**通信作者 E-mail:xiejuan945@sohu.com

网络出版时间：2015-09-11网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2250.012.html

吴斯1， 谢娟1**，李龙宽2

(1.贵州医科大学附属人民医院， 贵州 贵阳550002； 2.贵州医科大学第三附属医院， 贵州 都匀558000)

[摘要]目的： 研究癫痫儿童血液中丙戊酸毒性代谢产物2-丙基-4-戊烯酸(4-ene-VPA)血药浓度与谷丙转氨酶(ALT)的关系。方法： 选取96例癫痫儿童作为研究对象，采用反向高效液相色谱法(RP-HLPC)法测定患儿血浆中4-ene-VPA的血药浓度，采用常规生化检测法检测患儿静脉血中ALT的含量，并进行相关性分析。 结果： 0～≤2岁组癫痫患儿血浆中4-ene-VPA血药浓度与ALT正相关(P=0.018，r=0.621)关系。结论： 对于0～≤2岁癫痫患儿，服用丙戊酸时应重点监测肝功能。

[关键词]丙戊酸； 2-丙基-4-戊烯酸； 反向高效液相色谱法； 丙戊酸的代谢产物； 血药浓度

[基金项目]*贵州省卫生厅基金(项目编号：gzwkj2010-1-003)

[中图分类号]R917; R969.3

Correlation Analysis of Valproic Acid's Metabolites 2-propyl-

4-pentenoic in Plasma and Liver Function of Patients

WU Si1, XIE Juan2, LI Longkuan1

(1.People'sHospitalAffiliatedtoGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550002 ,Guizhou,China; 2.TheThirdAffiliated

HospitalofGuizhouMedicalUniversity,Duyun558000,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To explore the correlation between plasma concentration of sodium valproate's metabolites 2-propyl-4-pentenoic and ALT. Methods: A total of 96 cases of epileptic children patients who took sodium valproate medicine over 7 days and reached steady drug concentration in plasma were enrolled in this study. RP-HLPC was adopted to determine the blood concentration of 2-propyl-4-pentenoic. The ALT content in venous blood of patients was determined by conventional biochemical detection method. The correlation analysis between the blood concentration of 2-propyl-4-pentenoic and ALT content in venous blood was conducted by SPSS19.0. Results: The blood concentration of 2-propyl-4-pentenoic was positively correlated to ALT content in venous blood in 0～≤2 years old patients (P=0.018, r=0.621), but there was no significant correlation between the level of 4-ene-VPA and ALT in other age group. Conclusion： For 0～≤2 years old epileptic children patients who took sodium valproate, liver function should be monitored emphatically.

[Key words] valprioc acid; 2-propyl-4-pentenoic; reverse high-performance liquid chromatography; valproate's metabolites; plasma concentration

癫痫(epilepsy)是一种由多病因引起的慢性反复发作的神经系统疾病。据世界卫生组织(world heALTh organization，WHO)的报告癫痫的患病率在5.0‰～11.2‰，即大约全球有5 000万的活动性癫痫患者；我国的癫痫患病率为7.2‰，目前大约有900万的癫痫患者[1]。丙戊酸(valproic acid,VPA)是临床广泛使用的一线广谱抗癫痫药，是全面性发作及特发性全面性癫痫的首选药，也可用于治疗部分发作、继发性全面发作及脑病性癫痫[2]。VPA临床应用后，陆续有引起急性致死性肝坏死的报告。VPA诱发的肝衰竭多见于未成年或2岁以下的婴幼儿[3]，目前认为VPA诱导的肝毒性与其自身代谢产物2-丙基-4-戊烯酸(2-propyl-4-pentenoic，4-ene-VPA)有关，被认为是引起其肝毒性的物质[4]。本实验通过对4-ene-VPA浓度与未成年癫痫患者肝功能之间的关系进行研究，为临床合理用药提供理论基础。

1材料与方法

1.1药品与试剂

4-ene-VPA标准品(纯度98%，意大利Santa Cruz Biotechnology Inc),甲醇(色谱纯,美国Mreda Technologyinc Inc)，乙腈(色谱纯，天津市科密欧化工，批号2013111)，三乙胺(分析纯，成都市科龙化工， 辛酸(分析纯，生工生物)，对溴苯乙酰溴(纯度98%，阿拉丁试剂公司)，水为超纯水。

1.2仪器与色谱条件

Agilent 1260 infinity高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，梅特勒-托利多AL204分析天平，超纯水器 ，奥特赛恩AP-01P抽滤器， 江苏康健XH-B旋涡混合器，上海理达PHS-3C pH计。色谱柱为ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(75∶25)，柱温35 ℃，检测波长为256 nm，流速1.0 mL/min,进样量20 μL。

1.3研究对象

实验方案经医院伦理委员会讨论并批准。本实验共纳入96例癫痫患者，其中男63例，女33例,平均(8.0±4.8)岁，平均体重(28.3±19.4)kg，平均身高(113±35.0)cm；单纯服用VPA96例，合并服用吡拉西坦1例，合并服用卡马西平1例，合并服用托比酯和拉莫三嗪1例，合并左乙拉西坦3例。将96例患者按照年龄分为5组，0～≤2岁组(n=14)、≥3～≤6岁组(n=30)、≥7～≤10岁组(n=22)、≥11～≤14岁(n=21)和≥15～≤17岁(n=9)。受试者纳入标准包括：(1)根据2001年ILAE公布的癫痫发作分类及癫痫综合症分类标准确诊，癫痫且服用丙戊酸钠缓释片(杭州赛诺菲制药有限公司，规格500 mg/30片)或丙戊酸钠口服液(杭州赛诺菲制药有限公司，规格12 g∶300 mL)超过7 d以上，血药浓度达到稳态；(2)年龄在18周岁以下，性别不限；(3)患者监护人知情同意。排除标准主要有:(1)未按医嘱服用药物的患者；(2)患有消化系统疾病，如胃溃疡、十二指肠溃疡、完全或不完全肠梗阻；(3)入组前肝肾功能异常者。

1.4谷丙转氨酸(ALT)检测

ALT检测采用生化常规检测法。于患者次日服药前抽取外周静脉血置于抗凝管中，3 000 r/min离心5 min，取上层血浆置于EP管(1.5 mL)，-80 ℃冰箱保存，备用。

1.4.14-ene-VPA标准储备液和标准血浆样品精密称取4-ene-VPA标准品4.00 mg于10 mL的容量瓶中，加入乙腈溶液并稀释至刻度，即400 mg/L 4-ene-VPA储备液，4 ℃保存。取储备液分别配制10、20、40、80、160、200 mg/L 4 -ene-VPA标准溶液，4 ℃保存。取200 μL的血浆，加4-ene-VPA标准溶液20 μL，配制成浓度为1、2、4、8、16、20 mg/L 4-ene-VPA标准血浆样品，4 ℃保存。

(1)为验证本论文提出的SRBM算法预测评分的准确率，就硬聚类算法(K-means聚类算法)、隐语义模型(LFM)、自编码器(autoencoder)、RBM以及SRBM算法在不同数据稀疏情况下准确率进行了分析比较。如图8所示。

1.4.2内标精密称取正辛酸4.00 mg于10 mL容量瓶中，加入乙腈溶液并稀释至刻度，即得400 mg/L正辛酸储备液，4 ℃保存。取储备液配制4 mg/L内标液，4 ℃保存。

1.4.3衍生化试剂精密称取对溴苯乙酰溴50.00 mg于5 mL容量瓶中，加入甲醇溶液并稀释至刻度，即得10 g/L衍生化试剂，置4 ℃冰箱备用。

1.4.4血浆样品的处理及衍生化精密吸取200 μL的血浆样品置于1.5 mL Ep管中，加内标溶液20 μL，涡旋20 s,加2 mol/L硫酸100 μL，涡旋20 s；加1 mL乙酸乙酯进行萃取，涡旋1 min，静置5 min，12 000 r/min离心10 min。吸取上清液置于1.5 mL Ep管中，加入30 μL三乙胺，20 μL对溴苯乙酰溴，涡旋20 s；70 ℃水浴30 min，氮气挥干，残渣用100 μL甲醇复溶，涡旋20 s，20 μL进样。

1.5数据处理与分析

2结果

2.1方法学考察

4-ene-VPA和内标正辛酸与血浆中其他组份分离良好，保留时间分别为8.92 min和13.15 min。4-ene-VPA浓度在1～20 mg/L时呈良好线性关系y=0.268 0x+0.4119(r=0.992 8)，最低定量限为1 mg/L。在低、中、高质量浓度分别为0.061、0.004、0.016 mg/L下的回收率分别为114.5%，109.3%和97.1%。日间、日内RSD<15%(n=5)，符合生物样品分析要求。

2.2不同年龄组4-ene-VPA血药浓度与ALT的关系

表1　4-ene-VPA血药浓度与

(1)P<0.05

注：A为0～≤2岁组患者4-ene-VPA血药浓度的范围，B为 ≥3～≤6岁岁组患者4-ene-VPA血药浓度的围，C为≥7～ ≤10岁4-ene-VPA组患者血药浓度的范围，D为≥11～ ≤14岁4-ene-VPA组患者血药浓度的范围，F为 ≥15～≤17岁岁组患者血药浓度的范围 图1　各年龄组4-ene-VPA血药浓度的范围 Fig.1The blood concentration of 4-ene-VPA in different age groups

3讨论

研究报道证实VPA所致肝脏病变均与其自身代谢致毒有关。约97%VPA通过由肝脏代谢。在肝脏内至少有3条途径介导VPA的代谢，其中40%经线粒体ω-氧化途径，30%～50%经由葡萄糖醛酸化途径，10%～20%参与CYP450介导的β-氧化代谢，代谢途径特征导致VPA的代谢产物多达50种[5-6]。4-ene-VPA是VPA经由CYP2C9、CYP2A6及CYP2B6代谢的产物，其中以CYP2C9、CYP2A6为主,。研究证实4-ene-VPA是致使VPA产生肝毒性的物质[7]。

4-ene-VPA在细胞内线粒体中在短/支链酰基-CoA脱氢酶(ACADSB)介导下生成4-ene-VPA-巯基辅酶A(4-ene-VPA-CoAthioester),再经β氧化生成(E)-2,4-diene VPA-巯基辅酶A[(E)-2,4-diene VPA-CoAthioester]过程中消耗了大量谷胱甘肽(CSP)，导致CSP局部耗竭[8-9]。由于线粒体是依靠GSH防止脂质过氧化反应，CSP的消耗造成了线粒体的功能障碍，导致肝细胞毒性。GSH是真核细胞中最丰富的巯基抗氧化剂，可与体内生成的氧化产物反应，从而减弱氧化应激；同时游离的辅酶A(CoA)在此过程中被恶意性消耗，造成CoA缺乏，使得内源性脂肪酸CoA依赖型氧化代谢反应受阻，能量生成障碍，最终导致细胞死亡。有研究指出4-ene-VPA浓度与VPA的浓度呈非线性关系[10]，因此有必要建立一种简单快速的分析方法来对4-ene-VPA浓度进行分析。

本次研究发现0～≤2岁癫痫患儿的4-ene-VPA浓度与ALT(P=0.018，r=0.521)显著相关，说明在特定范围内C4-ene-VPA对患者肝功能是有指导意义的。ALT是临床常用的检测肝细胞损伤的指标，当肝细胞膜受损或细胞坏死时，ALT进入血清便增多，通过测定血清或血浆ALT的活性，即可反映肝细胞受损情况及损伤程度。因此可以得出2岁以下的儿童是VPA诱发的肝衰竭的危险人群。这与全美关于VPA致死性肝毒性病例资料调查回顾性得出的结论一致[11]，这可能是因为婴幼儿时期代谢酶的种类及功能尚未发育完全。0～≤2岁的癫痫患儿作为肝损伤的高危人群，4-ene-VPA血药浓度对其伤害程度较大，4-ene-VPA血药浓度与ALT正相关的，所以对于2岁以下婴幼儿，应重点关注肝功能的变化，及时调整给药方案。

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(2015-04-20收稿，2015-08-01修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 刘华