非诺贝特对过氧化物酶体增殖物激活受体α和单核细胞趋化蛋白-1的影响

陈福生蒲晓群1

(株州恺德心血管病医院心内科，湖南株洲412007)

摘要〔〕目的观察非诺贝特对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、单核细胞过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα) 和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的影响。方法体外培养HUVEC株，第3～5代用于实验。实验分3组：①空白对照组；②ox-LDL组(100 mg/L)；③非诺贝特组：先将非诺贝特10、50、100 μmol/L分别作用于内皮细胞24 h，然后加ox-LDL(100 mg/L)作用于细胞24 h。采用细胞酶联免疫吸附法分析检测细胞培养上清液PPARα、MCP-1含量；采用四唑盐比色法检测各孔的吸收度(OD)，以评价增殖效果。结果与空白对照组比较，100 mg/L ox-LDL促进内皮细胞增殖(P

关键词〔〕氧化型低密度脂蛋白；脐静脉；单核细胞过氧化物酶体增殖物激活受体α；单核细胞趋化蛋白-1；非诺贝特；动脉粥样硬化

中图分类号〔〕R39〔文献标识码〕A〔

1中南大学湘雅医院心内科

第一作者：陈福生(1973-)，男，硕士，主要从事冠心病介入治疗、药物治疗研究。

动脉粥样硬化(AS)是缺血性心脑血管疾病的基础。AS不仅仅是脂质的沉积，更是一种慢性炎症性疾病〔1〕。单核细胞在AS病变损伤区黏附、聚集并且进入血管内膜下组织，进而吞噬氧化低密度脂蛋白等，转化成为泡沫细胞，这是AS形成早期的关键步骤之一。对于单核细胞的黏附和聚集，血管细胞黏附分子(VCAM)-1、细胞间黏附分子(ICAM)-1、E-选择素(E-selectin)、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、白细胞介素(IL)-8等都起了非常重要的作用，其中MCP-1对单核细胞的趋化起着尤为关键的作用〔2，3〕单核细胞过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α活化能抑制炎症反应而对AS产生影响。本实验以人脐静脉内皮细胞为研究对象，观察贝特类药物非诺贝特通过激活PPARα，对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及MCP-1分泌的影响，为预防AS提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料HUVECs购自澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司。ox-LDL购自中国协和医科大学基础研究所。DMEM、胰蛋白酶均购自美国Amresco公司；PPARα、MCP-1试剂盒购自美国R&D公司，M199干粉培养基，美国Gibco公司生产。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，上海碧云天生物技术有限公司。非诺贝特及MTT购于美国Sigma公司；培养板购自加拿大Biofil公司。

1.2方法

1.2.1HUVECs的培养和处理取HUVECs解冻，待复苏后，加入含10%小牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，接种于培养瓶中，置于5%CO2培养箱中37℃培养。取处于对数生长期的3～5代HUVECs进行消化，制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104/ml接种于6孔培养板，每孔分别2 ml，置于CO2培养箱静置培养24 h。然后更换乏血清培养基(M199+2%胎牛血清+1%HEPES)继续培养6 h，使细胞同步化于G0/G1实验。随机分为3组：①空白对照组；②ox-LDL组(100 mg/L)；③非诺贝特组：非诺贝特10、50、100 μmol/L。每组设3个复孔，其中非诺贝特组先用上述药物预处理细胞24 h后，再给ox-LDL(100 mg/L)作用于细胞24 h。然后用0.125%胰蛋白酶进行消化，制备细胞悬液用于实验。实验重复3次。

1.2.2细胞培养上清液PPARα、MCP-1含量测定试剂盒购自美国R&D公司，采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定，严格按照说明书操作。过程简述如下：酶标板中，各孔均加入50 μl孵育液，标准孔内加入不同浓度的标准PPARα、MCP-1溶液50 μl，待测孔内加入稀释后的细胞培养上清液50 μl，再加入Biotin标记的抗PPARα、MCP-1 50 μl，室温孵育2 h后，洗板4次，加入HRP标记的工作液100 μl，室温孵育30 min，洗板后加入显色液100 μl，再次室温避光孵育25 min，加入终止液100 μl终止反应，以酶标仪450 nm读取吸光度值。以标准液的吸光度值对应标准液浓度作图，并拟和吸光度值相对应于MCP-1、PPARα的浓度的计算公式，计算待测样本中PPARα、MCP-1的含量，根据稀释倍数计算细胞培养上清液中PPARα、MCP-1的浓度。

1.2.3MTT法评价细胞增殖MTT法将HUVECs以每孔1×104/ml接种于96孔板，每孔200 μl，各实验组ox-LDL刺激内皮细胞24 h后，每孔加入MTT(浓度为5 mg/ml)继续孵育4 h，弃上清液，加入DMSO 显色酶标仪检测各孔吸光度A630和A570，A630-A570即为测定值。

1.3统计学方法采用SPSS11.5统计软件行t检验及单因素方差分析。

2结果

2.1HUVECs形态学观察倒置显微镜下观察可见，正常的内皮细胞起初呈圆形或椭圆形，多呈小团存在，4 h后开始贴壁，细胞贴壁生长良好，早期细胞呈小多角形、球形、团状，逐渐生长成梭形，胞体呈多角形，相互嵌合，呈铺路石状镶嵌排列，细胞透明度大。

2.2各组及不同浓度非诺贝特对HUVECs增殖及PPARα、MCP-1分泌的影响各组及不同浓度非诺贝特对HUVECs增殖及PPARα、MCP-1分泌的影响，见表1。

组别HUVECs增殖PPARα(pg/ml)MCP-1(pg/ml)空白对照组0.425±0.026128.68±56.76150.13±69.29ox-LDL组0.767±0.0481)78.56±38.421)889.26±92.391)非诺贝特10μmol/L0.656±0.0381)286.96±52.761)629.41±51.971)非诺贝特50μmol/L0.576±0.0322)516.86±65.462)432.56±46.192)非诺贝特100μmol/L0.465±0.0262)767.69±89.762)292.66±34.652)

与空白对照组比较:1)P<0.01；与ox-LDL组比较:2)P<0.01

3讨论

AS是重要的心血管疾病之一，其发病机制仍未完全阐明。近年研究认为，AS发生的始动环节是血管内皮细胞(VEC)的损伤，低密度脂蛋白(LDL)通过损伤的血管内皮细胞间隙弥散进入血管内皮下，被自由基和活性氧等修饰氧化为ox-LDL〔4〕。ox-LDL可诱导多种炎性因子的表达，如细胞间黏附因子-1、VCAM-1、MCP-1等，其中，MCP-1在AS的发生发展中起关键作用。MCP-1能与单核细胞表面的 CC类趋化因子受体2(CCR2)受体特异结合，使单核细胞经损伤内皮细胞间隙迁移入内皮下，演变为巨噬细胞，巨噬细胞通过清道夫受体不断吞噬ox-LDL，启动了炎症反应过程，巨噬细胞吞噬脂质构成泡沫细胞，平滑肌细胞增殖、移动，最终形成脂纹和粥样斑块〔5，6〕抗MCP-1基因转染不仅显著抑制AS斑块的起始和发生，而且还能限制AS斑块的进展，使不稳定的AS斑块转化为更稳定的AS斑块。Porreca等〔7〕研究发现，MCP-l不仅是趋化激活因子，对泡沫细胞形成极为重要，又能促进人脐静脉血管平滑肌(HUVSMC)增殖。本研究也发现ox-LDL诱导HUVEC高表达MCP-1，也能促进HUVEC增殖，从而促进AS的发生和发展〔8〕。研究报道在培养的内皮细胞和LDL注射胎牛血清，非诺贝特可抑制ox-LDL和LDL诱导的氧化应激，抑制内皮细胞增殖。本实验发现，非诺贝特对ox-LDL诱导的人HUVEC MCP-1分泌有抑制作用，抑制内皮细胞增殖，阻止AS发展〔9〕。

非诺贝特是一种人工合成的PPARα的激活物，是广泛用于治疗高甘油三酯的降脂药物。PPARα激动剂可调节脂质代谢，也可通过不依赖降脂作用在不同阶段阻碍AS的进程。早期可改善动脉血管的顺应性；其次可减少炎症因子水平〔10〕。激活的PPARα可以降低炎症因子的基因表达、减轻细胞间的黏附和迁移，改善内皮细胞的功能〔11〕。PPARα的活化可改变血液中LDL与高密度脂蛋白(HDL)的比值，升高HDL、降低LDL，增加胆固醇的清除，从而减少泡沫细胞的形成，减缓AS〔12〕。PPARα的激活剂非诺贝特可以通过抑制活化蛋白-1、核转录因子-κB的活化，下调活性氧等途径，减少MCP-1的表达，从而减少血管壁单核细胞的聚集，降低炎症反应，保护内皮细胞。本实验结果说明非诺贝特通过激活PPARα，从而抑制HUVEC增殖及MCP-1分泌。

本实验说明，非诺贝特呈剂量依赖性促进ox-LDL诱导的人HUVEC分泌PPARα，抑制人HUVEC分泌MCP-1，抑制内皮细胞增殖，揭示非诺贝特具有抗炎效应，是保护内皮功能的又一途径。因此，临床上应用抗AS一方面发挥其高效的降脂作用，还可以行使其保护内皮及AS的功能。

4参考文献

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12Dragomir E，Tircol M，Manduteanu I，etal.Aspirin and PPAR-alpha activators inhibit monocyte chemoattactant protein-1 expression induced by high glucose concentration in human endothelial cells〔J〕.Vasc Pharmacol，2006；44(6) :440-9.

〔2013-11-18修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)