董文宾， 王世鹏

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安　710021)



微波法辅提灵芝多糖及体外抗氧化研究

董文宾， 王世鹏

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安710021)

摘要：本实验采用单因素及正交试验对微波法辅提灵芝多糖提取工艺条件进行优化，以抗坏血酸为阳性对照对灵芝粗多糖体外抗氧化活性进行评价.实验结果显示灵芝经蒸馏水预浸泡1 h后在温度60 ℃、料水比1∶40、微波功率100 W、微波时间30 min的提取条件下多糖得率最高.灵芝粗多糖体外抗氧化活性试验证明灵芝粗多糖有一定的体外抗氧化活性且与浓度呈正相关，但总体不及抗坏血酸.当灵芝多糖浓度为2 mg/mL时，对·OH和O2-·的清除能力最大分别为62.07%和 55.39%，说明其对活性氧自由基的清除具有选择性，可能与其粗多糖中的杂质、多糖结构和清除机理有关.

关键词：灵芝多糖； 微波法； 体外抗氧化

0引言

灵芝(Ganoderma Lucidum)又称为灵芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株，寄生于栎及其它阔叶树根部的多孔菌科真菌[1].现代药理学研究[2-5]证实灵芝具有增强机体免疫，提高机体耐缺氧能力，抑制肿瘤，保肝护肝清除自由基以延缓衰老等多方面的药理活性.本实验所用灵芝孢子粉经鉴定为赤芝，灵芝多糖含量为2.2%～2.6%.

灵芝多糖因可溶于水，目前多采用水、稀碱、稀酸以及二甲基亚砜作为溶剂提取灵芝多糖[6-8].水浸提法多糖得率低且耗时长，采用稀酸、稀碱浸提时可提升多糖得率,但对多糖的组织结构损害较大，采用二甲基亚砜作为浸提溶剂时二甲基亚砜价格昂贵且对人体有害,在实际应用中阻力较大[9].研究显示采用微波法提取灵芝多糖具有得率高，对多糖组织结构损伤小、操作简便等优点[10,11].本实验通过单因素及正交试验进一步优化微波法提取多糖工艺.

灵芝多糖是灵芝中的一种重要的活性成分，逐渐成为研究热点，本实验通过检测灵芝多糖的体外抗氧化活性，以期对灵芝多糖的药用和保健价值做出判断，并促进灵芝多糖产品进一步开发.

1材料与方法

1.1实验材料与试剂

(1)材料：灵芝孢子粉购于山西农业大学食用菌中心，该灵芝经鉴定为赤芝.

(2)试剂：丙酮、浓硫酸、L-抗坏血酸、30%双氧水(H2O2)、水杨酸、Tris、邻苯三酚、三氯乙酸、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、铁氰化钾(K3Fe(CN)6)、亚硝酸钠(NaNO2)、盐酸-α-奈胺、对氨基苯磺酸，试剂均为分析纯.

1.2实验仪器设备

TDA-8002-电热恒温水浴锅(北京化玻联医疗器械有限公司)；BS224S-电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；WFJ2100型-可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；TDL-4-台式离心机(上海安亭科学仪器厂制造)；DHG-9243BS-Ⅲ-电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；SHB-3-真空抽滤机(郑州长城科工贸有限公司).

1.3实验方法

1.3.1灵芝多糖的制备工艺

灵芝孢子粉→蒸馏水浸泡→微波预处理→离心取上清液→乙醇沉淀→灵芝多糖.

1.3.2灵芝多糖的工艺优化

(1)提取方法单因素试验

考察微波功率、温度、料水比、微波时间对微波法提取灵芝粗多糖得率的影响.

(2)提取方法正交试验

根据单因素试验，通过L934正交试验选择浸提温度、料水比、微波功率、微波对微波法提取灵芝粗多糖进行条件优化.

1.3.3灵芝多糖得率的测定

本实验根据《中国药典》规定的灵芝多糖硫酸蒽酮比色法检测灵芝多糖得率，具体采用90%硫酸-蒽酮法水浴10 min测定多糖提取率[12].

1.3.4灵芝粗多糖的抗氧化活性研究

(1)粗多糖对羟基自由基(·OH)清除能力的研究

将粗多糖用蒸馏水溶解，配成2 mg/mL溶液，并进行梯度稀释.在试管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，待测样液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，摇匀，静置10 min，然后加入6 mmol/L的水杨酸溶液2 mL，摇匀，放入37 ℃水浴锅中加热30 min后取出，待到室温后于510 nm处测其吸光度(Ai)；另取2支试管，分别做空白(Ac)和样品对照(Aj).以Vc做为阳性对照，测定在相同条件下对·OH的清除能力进行测定.按下式计算各待测样品对羟自由基(·OH)的清除率[13].

羟基自由基(·OH)清除率(%)=

式中：Ai—表示样液与水杨酸溶液混合液的吸光值；Aj—表示样液与空白溶剂混合液的吸光值；Ac—表示水杨酸溶液与空白溶剂混合液的吸光值.

(2)粗多糖对超氧阴离子(O2-·)自由基清除能力的研究

将粗多糖用蒸馏水溶解，配成2 mg/mL溶液，并进行梯度稀释.取试样100μL，0.1 mol/L的Tris-HCl 1.8 mL和蒸馏水1.0 mL，放入同一试管中，25 ℃水浴保温10 min，加入同样温浴的3 mmol/L的邻苯三酚100μL，迅速混合，然后每隔30 s测定在325 nm处的吸光值，记为A样本.以10 mmol/L的HCl溶液配制空白管作为对照，记为A对照.得出A325随时间变化的曲线，重复三次，取平均值.以Vc作为阳性对照，进行相应的测定.按照下列公式计算待测样品对超氧阴离子自由基的清除能力[14-16].

(3)粗多糖还原能力的研究

将粗多糖用蒸馏水溶解，配成2 mg/mL溶液，并作梯度稀释.取0.5 mL不同浓度的样品，加入1.25 mL磷酸缓冲液(PBS，pH=6.6，0.2 mol/L)和1.25 mL 1%(w/v)K3Fe(CN)6，在50 ℃下反应20 min，而后加入1.25 mL的三氯乙酸(10%，w/v)，在6 000 r/min下离心10 min，取上清夜3.0 mL与0.30 mL所配的FeCl3(0.1%，w/v)混合摇匀后，在700 nm处测定溶液的吸光度，重复以上操作3次,取平均值[14,15,17].以Vc做为阳性对照，测定其总还原力.

2结果与讨论

2.1微波法提取灵芝粗多糖的条件优化

2.1.1微波功率对灵芝粗多糖得率的影响

在温度50 ℃，料水比为1∶30，超声时间20 min,考察微波功率分别为0 W、100 W、300 W、500 W、700 W时对灵芝粗多糖得率的影响，结果如表1所示.

表1　微波功率对灵芝粗多糖得率的影响

从表1可看出，随着微波功率的增加，灵芝多糖的得率也随之增大，当微波功率达到500 W时多糖提取率最高，但当微波功率为700 W时多糖得率反而降低，这可能是微波功率过高使灵芝多糖结构发生了变化，说明微波功率对多糖得率有较大影响，最佳的微波功率条件是500 W.

2.1.2温度对灵芝粗多糖得率的影响

在微波功率为500 W，料水比为1∶30，超声时间20 min条件下, 考察温度分别为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃时对灵芝粗多糖得率的影响，结果如表2所示.

表2　温度对灵芝粗多糖得率的影响

从表2可看出，随温度升高，多糖分子移动加快利于溶出，当温度为60 ℃时多糖得率最高，但当温度为70 ℃时，可能由于温度过高对多糖组织结构造成破坏影响多糖的提取.

2.1.3料液比对灵芝粗多糖得率的影响

在温度60 ℃，微波功率为500 W，超声时间20 min，考察料水比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50对灵芝粗多糖得率的影响，结果如表3所示.

表3　料水比对灵芝粗多糖得率的影响

从表3可看出，随着加水量的增大多糖越易溶出，但加水量过高会使浓缩程序更加繁琐.当料水比为1∶40时多糖得率最高.

2.1.4微波时间比对灵芝粗多糖得率的影响

在温度50 ℃，料水比为1∶40，微波功率为500 W，考察超声时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min对灵芝粗多糖得率的影响，结果如表4所示.

表4　微波时间比对灵芝粗多糖得率的影响

从表4可看出，微波时间为30 min时多糖得率最高，之后随时间的延长多糖得率下降，时间的延长会对灵芝组织产生破坏利于多糖提取、但多糖结构也会发生变化.

2.2正交试验确定微波法提取灵芝粗多糖的最佳条件

通过单因素试验每个因素选择三个水平进行正交试验，结果如表5所示.

表5　微波法提取灵芝多糖正交试验结果

由表5可看出，微波法提取灵芝粗多糖的影响因素从小到大依次为D

2.3灵芝粗多糖的抗氧化活性测定

2.3.1灵芝粗多糖对·OH自由基的清除能力测定

灵芝粗多糖对·OH自由基的清除能力测定结果见图1所示.

图1　灵芝粗多糖对·OH自由基的清除能力测定

·OH一直被认为是毒性最强的活性氧自由基，是造成人体有机体过氧化损伤的主要因素，因此，对于清除·OH对人体的健康有非常重要的作用.由图1可以看出，虽然灵芝多糖对其有一定的清除能力，且随着浓度的增大清除率越来越大，增长速率也越来越快，但总体来说清除能力较弱.在试验范围内，灵芝粗多糖对·OH的清除能力最大为62.07%，而在与阳性对照Vc对比可知，其开始清除率增长速率较快，但随着浓度增大增长缓慢，在试验范围内最大清除率为79.76%，因此，同浓度下灵芝粗多糖对·OH清除能力较弱.

2.3.2灵芝粗多糖对O2-·自由基的清除能力测定

灵芝粗多糖对O2-·自由基的清除能力结果见图2所示.

图2　灵芝粗多糖对O2-·自由基的清除能力测定

O2-·在人体中含量过多会引起机体细胞结构与功能的损伤.不同浓度的灵芝粗多糖溶液加入到O2-·发生体系后，如图2所示，随着浓度的增大，清除率增长缓慢，浓度最大时清除率达到55.39%.与阳性对照Vc比较，Vc在试验条件下，当浓度较小时，清除率增长较慢，当浓度大于0.5 mg/mL时清除率增长较快，清除率较高，最大能达到69.05%.可见，同等浓度下，灵芝粗多糖溶液对O2-·的清除能力很弱，与Vc相差较大.

2.4粗多糖的还原能力的测定

粗多糖的还原能力测定结果见图3所示.

图3　灵芝粗多糖的还原能力测定

物质的还原能力可以反映其潜在的抗氧化活性，具有较好还原能力的物质通常是电子供体，能够清除脂质过氧化过程中的中间产物.由图3可看出，灵芝粗多糖的总的还原力一般，随着浓度的增大，总还原力增大，且增大速率越来越快.与阳性对照Vc相比可知，在试验范围内，灵芝粗多糖的还原能力与Vc的还原能力增长率相似，且总的还原力相差不大.

3结论

(1)通过单因素和正交试验对微波法提取灵芝粗多糖的工艺条件进行优化，结果为在温度60 ℃、料水比1∶40、微波功率100 W、微波时间30 min的条件下对灵芝进行预处理后，多糖提取率最高.

(2)实验中体外抗氧化活性试验结果显示，灵芝粗多糖对·OH的清除能力最大为62.07%，对O2-·清除能力可达到55.39%.

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Research in auxiliary mention and antioxidant in vitro

of ganoderma lucidum polysaccharides

DONG Wen-bin， WANG Shi-peng

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:In this paper,single factor and orthogonal experiments were designed to optimize the microwave extraction conditions of ganoderma lucidum polysaccharides from the aspects of temperature,material-water ratio,microwave power,microwave extraction time in this paper.Results showed that after pre-soaking in distilled water for an hour,when the temperature,material-water ratio,microwave power and microwave extraction time was respectively 60 ℃,1∶40,100 W,30 min,the obtaining rate of polysaccharides was the highest.It proved that ganoderma crude polysaccharides had some reducing ability and scavenging capacity of different radicals,which meant it had a certain selectivity of scavenging free radical.It might be related to impurities in the crude polysaccharides,polysaccharide structure and scavenging mechanisms.

Key words:ganoderma lucidum polysaceharide； microwave extraction； antioxidant

中图分类号：S646.19

文献标志码：A

文章编号：1000-5811(2015)05-0115-05

作者简介:董文宾(1951-)，男，陕西宝鸡人，教授，博士生导师，研究方向：功能食品

基金项目：陕西省科技厅科技计划项目(2013KTZB02-01-04)

收稿日期:*2015-07-21