贵州汉族老年人群载脂蛋白A5基因多态性与2型糖尿病的相关性

黄健黄韻祝杨国珍1蹇孝丽方礼琳

(贵州医科大学附属医院生化科，贵州贵阳550004)

摘要〔〕目的探讨载脂蛋白A5(ApoA5)基因-1131T>C及56C>G基因多态性与贵州汉族老年人群2型糖尿病(T2DM)及体内血脂水平的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)结合琼脂糖凝胶电泳技术检测100例健康人及142例T2DM患者ApoA5-1131T>C、56C>G基因型，并统计等位基因频率分布情况，同时测定所有对象的血脂、血糖水平。结果①T2DM组和对照组的ApoA5-1131T>C位点基因型频率比较差异显著(P=0.006)，等位基因频率比较无差异(P=0.349)；②对照组和T2DM组的ApoA5-1131C等位基因(TC+CC)携带者的甘油三酯(TG)均明显高于非C等位基因携带者(TT)(P<0.05)；③未发现ApoA5基因56C>G基因多态性。结论ApoA5-1131T>C基因多态性与贵州汉族老年人群T2DM的发病风险有关，携带C等位基因的人群发病风险更高，且C等位基因与TG水平增高有关；未检测出ApoA5基因56C>G基因多态性。

关键词〔〕载脂蛋白A5基因；单核苷酸多态性(SNP)；2型糖尿病(T2DM)

中图分类号〔〕R446.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家级教学团队专项基金(教高函〔2009〕18号)；贵州省2014年大学生创新创业训练计划项目(201410660016)

通讯作者：黄韻祝(1957-)，女，教授，主要从事血脂生化相关研究。

1贵州医科大学医学检验学院

第一作者：黄健(1981-)，男，副主任技师，主要从事血脂生化相关研究。

老年糖尿病以2型糖尿病(T2DM)居多，脂代谢异常在T2DM患者中表现突出，血浆甘油三酯(TG)升高是T2DM患者血脂代谢异常的主要特征之一〔1，2〕。研究表明，人类载脂蛋白A5(ApoA5)基因的单核苷酸突变(SNPs)对人群的TG含量有显著影响，其中ApoA5-1131T>C及56C>G两个位点基因多态性对血浆TG水平的影响较大〔3〕。由于基因多态性分布存在种族差异，本研究探讨ApoA5基因-1131T>C及56C>G基因多态性与贵州汉族老年人群2型糖尿病及体内血脂水平的关系。

1材料与方法

1.1研究对象纳入无亲缘关系的T2DM患者142例，其中男55例，女87例，平均年龄(62.00±7.68)岁，均符合世界卫生组织(WHO)1999年糖尿病诊断标准，所有病例均为贵州地区汉族人群，选自流行病学调查人群。同时选择血脂及血糖正常者100例作为对照组，男36例，女64例，平均年龄(60.8±8.15)岁，排除心、肺、肝、肾及内分泌疾病，全选自贵阳医学院附属医院体检中心，均为贵州地区汉族人群。

唐玉烟目光中泛起一丝惆怅，她望着洞外阵阵翻腾的云雾一阵失神，半晌才道：“其实，我是唐门副门主唐琮的亲传弟子。唐门是巴州第一豪族大派，表面看上去风光无限，但实际上，内部却是冲突不断。在高层之间，更是分化成了以门主唐烈为首的激进派和以副门主唐琮为首的保守派。唐烈野心勃勃，一心想称霸中州，唐琮则认为，称霸之事必会给唐门带来灾祸，是以极力反对。二人谁也奈何不得对方，两派陷入久持。

为了采摘方便，采用宽窄行种植采摘更方便，即采用1.2 m地膜，1膜4行，膜上行距30.0 cm，膜间行距60.0 cm，株距25.0 cm。宽窄行条播种植的特点，在田间栽培管理上便于中耕除草、灌溉等，利于摘花，节约种子，宽窄行条播种植还有利于进行间套种，以解决前后茬作物的季节矛盾[12]。

2.4ApoA5基因-1131T>C位点不同基因型研究对象血脂水平在对照组中，C等位基因携带者TG较非C等位基因携带者明显升高(P=0.02)，T2DM组中，C等位基因携带者TG水平亦明显高于非C等位基因携带者(P=0.01)；而TC、LDL-C、HDL-C在C等位基因与非C等位基因组间比较没有明显差异(P>0.05)。见表2。

1.3外周血基因组DNA提取抽取外周静脉血2 ml，EDTA(乙二胺四乙酸二钠)抗凝用于提取基因组DNA。按亚能生物技术有限公司DNA提取试剂盒说明书抽提基因组DNA。取5 μl基因组DNA与1 μl 6倍上样缓冲液点样，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，90 V电压电泳60 min。在凝胶成像仪上观察所提取的基因组DNA的亮度及纯度(此试剂盒提取的DNA在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳有一条清晰的约20 kb的DNA条带)。

取证工作录音录像制度最重要的是对讯问过程进行录音录像。从《监察法》的表述来看，讯问是录音录像最主要的对象，该法要求对讯问一律录音录像，不存在例外情况。《刑事诉讼法》要求录音录像制度适用的范围也是讯问犯罪嫌疑人的过程。对讯问进行录音录像主要是为了固定被告人的供述，防止其翻供。之前许多被告人在侦查阶段讯问中承认犯罪，但到了庭审中又当庭翻供，否认先前做过有罪供述，或者声称办案机关采取刑讯逼供、威胁、引诱、欺骗等方法获取其有罪供述。此时就需要通过录音录像还原讯问过程，证明供述真实性、取证合法性等事实，其他材料例如讯问笔录、健康体格检查报告等都无法达到录音录像的效果。

1.4ApoA5-1131T>C、56C>G位点的限制性片段长度多态性(RFLP)分析

在进行ApoA5基因56C>G基因多态性研究中，只检测出CC一种基因型，没有发现其他基因型，无法进行统计学分析，也无法分析这一位点与T2DM及血脂的关系，原因可能是标本量不足而使得该存在的差异没有表现出来。丁妍等〔12〕在对257名湖北省汉族人群56C>G位点研究中得出G等位基因频率小于1%，其认为ApoA5基因 56C>G是一个突变点而不是一个多态位点。在国外的一些研究结果表明〔13〕，这一稀有位点纯合携带者的TG水平比野生型明显增高。由于本次实验的样本量少，这个位点到底是突变点还是多态位点，需进一步证实。

1.4.2ApoA5-1131T>C位点PCR产物酶切取出现清晰的特异性条带PCR产物，以MseⅠ限制性内切酶进行消化(37℃水浴4 h)。酶切反应体系如下(20 μl)：10倍缓冲液2 μl，BSA 0.2 μl，MseⅠ0.5 μl，PCR产物8 μl，双蒸水补足体积。酶切产物用4%的琼脂糖凝胶电泳检测，80 V电压电泳2 h，在凝胶成像仪上观察并摄像。

1.4.356C>G位点PCR产物酶切取出现清晰的特异性条带PCR产物，以TaqⅠ限制性内切酶进行消化(65℃水浴2 h)。酶切反应体系如下(10 μl)：10倍缓冲液1 μl，BSA 1 μl，TaqⅠ0.5 μl，PCR产物8 μl，双蒸水补足体积。酶切产物用4%的琼脂糖凝胶电泳检测，80 V电压电泳2 h，在凝胶成像仪上观察并摄像。

2结果

2.1ApoA5基因-1131T>C、56C>G基因多态性检测结果

2.1.1ApoA5基因-1131T>C位点PCR酶切产物电泳结果-1131T>C位点位于ApoA5基因启动子区域，酶切产物电泳后可出现三种情况：133 bp和21 bp两条带的为TT野生型纯合子；只有154 bp一条带的为CC突变型纯合子；有154 bp，133 bp和21 bp三条带的为TC型杂合子(图1)。

技术要领指导：两臂保持分开，呈半弧形，在面对传球的时候，主动前迎。进行伸臂，同时保持身体的适当前倾，接球引胸前。

2.1.2ApoA5基因56C>G位点PCR酶切产物电泳结果ApoA5基因56C>G位点酶切产物有三种基因型：134 bp和23 bp两条带的为CC野生型纯合子；只有157 bp一条带的为GG突变型纯合子；有157 bp，134 bp和23 bp三条带的为CG型杂合子(图2)。

2.2ApoA5基因56C>G位点基因型及等位基因频率分布情况ApoA5基因56C>G位点位于ApoA5基因第二外显子，PCR产物长度157 bp，TaqⅠ酶切电泳结果(图2)。本研究中仅检

测出CC一种基因型。

ApoA5基因是在2001年发现的一个新的载脂蛋白基因，研究表明，人类ApoA5基因的SNPs对人群的TG含量有显著影响，而ApoA5调节TG的作用机制目前仍在研究当中〔5，6〕。可能是通过增强脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性，抑制ApoB和ApoC3的作用，加速血浆VLDL的清除来降低TG。很多患者在糖代谢异常之前就已经出现了脂代谢紊乱，常见血TG升高。San等〔7〕对6个家族性高甘油三酯血症(HTG)家系患者进行追踪，发现这类家系中T2DM的发病率明显增加，认为空腹血TG水平增高是发生T2DM的独立预测指标。

1.2血浆脂类水平及血糖的检测用生化管抽取所有研究对象早晨空腹外周血5 ml，室温下3 000 r/min离心5 min，取上层血清使用奥林巴斯5400全自动生化分析仪测定血脂代谢及血糖相关指标。

在该翻转装置的受力情况下，运用经典力学理论对设计的夹具进行了校核设计，并且运用有限元分析手段，对薄弱的零部件进行了静态强度分析。最终，通过试验验证了设计的可行性。

1～5：CC基因型 图2　ApoA5基因56C>G位点限制性片段长度多态性分析

组别n基因型频率TTTCCC等位基因频率TC对照组10051(51.0)33(33.0)16(16.0)135(67.5)65(32.5)T2DM组14252(36.6)76(53.5)1)14(9.9)180(63.4)104(36.6)

与对照组比较：1)P<0.01

表2　ApoA5基因-1131T>C位点不同基因型的血脂水平比较

与对照组TT比较：1)P<0.05；与T2DM组TT比较：2)P<0.05

3讨论

2.3ApoA5基因-1131T>C位点的基因型及等位基因频率在T2DM组及对照组中分布两组人群ApoA5基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。T2DM组的TC型基因型频率显著高于对照组(P=0.006)。见表1。

临床研究证实，ApoA5基因多态性与代谢综合征和血糖代谢异常存在相关性，而在其具体机制上，除去经由血脂相关的作用途径外，是否还额外存在其他独立的风险，目前仍存在争议。本研究发现对照组与2型糖尿病组人群的ApoA5-1131T>C位点基因型频率比较有显著性差异，与血脂关系的研究显示对照组和T2DM组的C等位基因(TC+CC)携带者的TG均明显高于非C等位基因携带者(TT)。此结果与国内翟光华等〔8〕对ApoA5基因多态性与中国镇江地区T2DM的相关性研究的研究结果相似，提示ApoA5-1131C等位基因可能与T2DM的发生、发展有关。但肖辉等〔9〕对ApoA5-1131T>C基因多态性与维吾尔族T2DM的关联研究发现ApoA5-1131C基因多态性与新疆维吾尔族的T2DM的发生并不具有相关性，但与TG水平相关。以上研究结果的差异可能是与试验方法及研究的对象不同有关系，也可能提示ApoA5-1131T>C基因多态性与T2DM的相关性可能具有人群异质性，要揭示其具体关系尚需更大样本量研究。同时本研究显示贵州地区汉族人群的ApoA5基因-1131C等位基因频率为32.5%，与日本人相似，高于西方人，这与国内的一些研究结果也相符〔10，11〕。说明C等位基因在亚洲人群中更为常见，这可能是不同的人种和民族，其遗传背景、生存环境等多重因素共同影响的结果。

1.4.1PCR扩增引物设计参考相关文献设计〔4〕如下：-1131T>C位点上游5′GGAGCTTGTGAACGTGTGTATGAGT3′，下游5′CCCCAGGAACTGGAGCGAAATT3′。56C>G位点上游5′GGCTCTTCTTTCAGGTGGGTCTCCG3′，下游5′GCCTTTCCGTGC CTGGGTGGT3′。由宝生物工程有限公司合成，原液配制成10 μmol/L的溶液备用。PCR扩增反应体系(25 μl)：包括Premix Taq 12.5 μl，模板DNA 3 μl，上下引物各0.3 μl，双蒸水补足体积。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，59℃复性30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，最后72℃延伸7 min。PCR产物5 μl用2%的琼脂糖凝胶中电泳(90 V 40 min)，在凝胶成像仪上观察并摄像，结合DNA Marker判断是否为目的DNA。

Pim-1蛋白主要表达于癌细胞胞浆中，少数表达于细胞核中，表现为棕黄色或深棕色的颗粒沉积(图1)。122例癌组织、相对应的癌旁组织及85例正常肝组织中，Pim-1的总阳性表达率分别为88.5%、73.0%、69.4%，差异有统计学意义(χ2=13.2530，P=0.0013)。与癌旁组织及正常肝组织比较，癌组织中Pim-1蛋白的总阳性率显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)；但癌旁组织和正常肝组织中的总阳性率无统计学差异(P>0.05)。提示Pim-1蛋白在PHC组织中的表达量显著升高，其总阳性率为PHC组织>癌旁组织>正常肝组织。

4参考文献

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当今社会石油产品供应越来越紧张，天然气放空造成了极大的浪费和环境污染，加之环保意识的增强和能源可持续发展的要求，放空天然气回收工作越来越受到重视[1]。冀东油田、胜利油田、大港油田等各大油田公司较早就对天然气放空的问题非常重视，组织开展了放空天然气的回收规划设计工作，并逐步实施[2]。目前各油田公司所使用的天然气回收利用技术主要有CNG技术和脱烃工艺技术等，CNG技术主要是通过将天然气进行脱水之后而被压缩至20 MPa，然后将其充入至专门的CNG拖车之中；脱烃工艺技术主要是外冷脱烃和膨胀制冷脱烃[3]；表1比对分析了5种放空回收方法[4-9]。表2对比了国内外高压气田放空天然气回收现状。

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1.3.2 样品前处理 除去树莓果实中的杂质，匀浆后烘干。准确称量树莓果实粗粉20.00 g，包入滤纸中放于提取器内，60℃下甲醇提取4 h后收集提取液。甲醇提取液在50℃以下真空蒸发回收溶剂后，甲醇提取物以1.00 g甲醇提取物加100 mL 10%甲醇的比例溶解，再以乙醚萃取3次(液比1∶3)，合并乙醚萃取液，蒸发溶剂得到红棕色油状浸膏1.00 g。

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2018年以来，中国家电市场整体面临的压力较大，从下图中的数据我们可以看出，2017年全年，中国家电市场零售额增速为11.8%，而2018年截至11月份，增速只有1.6%，大约只有去年全年增速的七分之一，今年的中国家电零售业可能将迎来整体“失速”的危机。

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〔2014-03-11修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)