沉默LAIR-1表达对乳腺癌细胞增殖和侵袭功能的影响

赵徽安雪青吕健东

(天津市第五中心医院普外科，天津300450)

摘要〔〕目的探讨白细胞相关免疫球蛋白样受体(LAIR)-1在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法采用RT-PCR方法检测乳腺癌细胞系和组织标本中LAIR-1 mRNA的表达情况。采用电穿孔转染法，将LAIR-1 siRNA转染MCF-7细胞，通过Western印迹检测LAIR-1在MCF-7细胞中的表达情况。通过四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)增殖实验检测LAIR-1对MCF-7细胞增殖的影响。通过伤Boyden小室检测LAIR-1对MCF-7细胞侵袭能力的影响。结果同癌旁组织相比，乳腺癌组织中LAIR-1 mRNA的表达量显著降低(P<0.01)；且同非转移性乳腺癌组织相比，转移性乳腺癌组织中LAIR-1 mRNA的表达量亦显著降低(P<0.01)。转染LAIR-1 siRNA可显著抑制MCF-7细胞中LAIR-1的表达。抑制LAIR-1表达后，MCF-7细胞的增殖和侵袭能力均显著升高(P<0.01)。结论LAIR-1具有抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭的作用，乳腺癌组织中LAIR-1的低表达可能与乳腺癌的发生发展相关。

关键词〔〕白细胞相关免疫球蛋白样受体-1；乳腺癌；增殖；侵袭

中图分类号〔〕R739〔文献标识码〕A〔

通讯作者：吕健东(1967-)，男，硕士，主任医师，主要从事甲状腺、乳腺、胃肠道肿瘤研究。

第一作者：赵徽(1985-)， 女，硕士，主要从事专业乳腺外科研究。

乳腺癌转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因，然而乳腺癌转移的机制目前尚未完全研究清楚。白细胞相关免疫球蛋白样受体(LAIR)-1是一种具有免疫抑制功能的受体〔1〕。研究表明，LAIR-1分子在卵巢癌组织细胞和细胞系中存在不同水平的表达，且沉默卵巢癌细胞系(HO8910)细胞中LAIR-1分子表达可明显增强HO8910细胞的增殖能力〔2〕。关于LAIR-1分子在乳腺癌组织中的表达情况及其与乳腺癌发生发展的关系目前还未见相关文献报道。本文旨在探讨LAIR-1分子在乳腺癌发生发展中的作用，以期为乳腺癌诊断寻找一个新的有效的肿瘤分子标志物。

1材料与方法

1.1临床资料选取2013 年10月11日至2014 年12月30日我院乳腺外科收治的乳腺癌患者60例，平均年龄(61.3±14.8)岁，其中转移性乳腺癌患者和非转移性乳腺癌患者各30例。术前均未接受任何放化疗和免疫治疗。收取乳腺癌患者的癌组织标本和癌旁组织标本，离体后均立即冻存于液氮中，均经过组织病理学诊断证实为乳腺癌。

1.2细胞及主要试剂人乳腺癌细胞系(MD231)及MCF7细胞均购自中国医学科学院基础医学研究所，细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。胎牛血清及DMEM培养基购自Hyclone公司，Lonza转染试剂购自Lonza公司； TRIzol购自美国Invitrogen公司；SYBR Green PCR试剂盒购自Ambion公司；侵袭实验用Boyden小室购自美国Millipore公司。

1.3RT-PCR 取出液氮中保存的组织，研碎，采用Trizol提取组织RNA，反转录成cDNA。聚合酶链反应(PCR)条件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，共40个循环。以2-△△Ct方法计数LAIR-1的相对表达量。LAIR-1上游引物：5'-CCGTCGGACAACAGTCACAA-3'；下游引物：5'-CGTCGGACAACAGTCACAATTT-3'。细胞长至70%融合时可用于转染。严格按照Lonza转染说明书进行操作，转染36 h后可用于功能实验〔3〕。采用Western印迹方法检测MCF-7细胞中LAIR-1的表达情况〔4〕，四甲偶氮唑蓝比色(MTT)方法检测LAIR-1对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响〔5〕。采用Boyden小室分析检测细胞侵袭能力〔5〕。

1.4统计学方法应用SPSS16.0软件进行t检验。

2结果

2.1LAIR-1在乳腺癌组织及乳腺癌细胞系中的表达乳腺癌癌旁组织中，LAIR-1的相对表达量为1.38±0.15，乳腺癌组织中为0.54±0.05，二者相比差异显著(P<0.01)。非转移性乳腺癌组织中的LAIR-1的相对表达量为0.64±0.11，转移性乳腺癌组织中为0.33±0.02，二者相比差异显著(P<0.01)。低侵袭能力的乳腺癌细胞系MCF-7中LAIR-1的相对表达量为0.93±0.22，高侵袭能力的乳腺癌细胞系MD231中为0.69±0.16，二者相比差异显著(P<0.01)。

2.2转染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7细胞中LAIR-1表达检测转染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7细胞中LAIR-1的表达被显著抑制。见图1。

图1　转染LAIR-1 siRNA的乳腺癌 MCF-7细胞中LAIR-1表达检测

2.3siRNA干扰抑制LAIR-1增加乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力乳腺癌MCF-7细胞转染第3天时，增殖能力在模拟组、对照组和转染LAIR-1 siRNA组分别为(0.67±0.11)、(0.69±0.09)和(1.14±0.14)；第5天时，分别为(1.17±0.21)、(1.19±0.18)和(2.07±0.41)；第7天时，分别为(1.86±0.23)、(1.91±0.25)和(2.56±0.26)。转染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7细胞增殖能力显著升高(P<0.01)。

2.4siRNA干扰抑制LAIR-1增加乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力转染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7细胞发生侵袭的细胞数分别为(46.24±13.54)、(45.36±15.63)和(106.13±25.46)。转染LAIR-1 siRNA的乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力显著升高(P<0.01)。见图2。

图2　LAIR-1对乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力的影响

3讨论

肿瘤是世界人口死亡的第2大原因，近30年来世界范围内肿瘤致死率增加近2倍〔6〕。肿瘤种类约有200多种，其中乳腺癌、肺癌、结直肠癌和前列腺癌总发病率约占所有癌症发生率的一半以上〔7〕。乳腺癌是肿瘤最常见的一种类型，占肿瘤发病率的27%，致死率占肿瘤致死率的16%。已知乳腺癌转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。然而，乳腺癌转移的机制目前尚未完全研究清楚。

LAIR-1是一种具有免疫抑制功能的受体，含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)〔2～4〕。LAIR-1主要表达于髓系细胞和淋巴细胞中，包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、单核细胞来源树突细胞(DC)和造血祖细胞〔8～10〕。结合以往研究结果证实高表达于免疫细胞的多种抑制性受体家族成员，

如程序死亡受体-1(PD-1)和NK细胞抑制性受体(NKG2A)均与肿瘤免疫逃逸相关。国内已有研究发现，肿瘤细胞也表达LAIR-1〔11〕，推测LAIR-1与肿瘤的发生发展相关。研究表明，LAIR-1分子在卵巢癌组织细胞和细胞系中存在不同水平的表达，且沉默卵巢癌细胞系(HO8910)细胞中LAIR-1分子表达可明显增强HO8910细胞的增殖能力。虽然已证实LAIR-1在卵巢癌中发挥重要作用，但关于LAIR-1表达于乳腺癌肿瘤细胞的报道还没有，且其作用机制尚未完全明确。

本研究结果初步提示LAIR-1分子与乳腺癌的发生发展密切相关。另外，当敲低乳腺癌MCF-7细胞中LAIR-1分子的表达后，乳腺癌MCF-7细胞的增殖和侵袭能力均显著升高。

综上，LAIR-1分子可通过影响乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力进而发挥乳腺癌抑制作用。乳腺癌中LAIR-1分子表达的显著降低与乳腺癌的发生和发展密切相关。

4参考文献

1王雷，马菲，郭宝良.MicroRNA在三阴型乳腺癌中的研究进展〔J〕.中国普通外科杂志，2013;22(11)：1490-4.

2何晓丽，付爱丽，曹奇志，等.沉默LAIR-1表达对卵巢癌细胞增殖功能的影响〔J〕.现代免疫学，2015;35(2)：119-23.

3Yin S,Zhang J,Mao Y,etal.Vav1-phospholipase C-γ1 (Vav1-PLC-γ1) pathway initiated by T cell antigen receptor (TCRγδ) activation is required to overcome inhibition by ubiquitin ligase Cbl-b during γδT cell cytotoxicity〔J〕.J Biol Chem,2013;288(37):26448-62.

4Kim HS,Das A,Gross CC,etal.Synergistic signals for natural cytotoxicity are required to overcome inhibition by c-Cbl ubiquitin ligase〔J〕.Immunity,2010;32(2):175-86.

5Wang X,Pan J,Li J.Cytokine-induced apoptosis inhibitor 1 inhibits the growth and proliferation of multiple myeloma〔J〕.Mol Med Rep,2015;12(2):2056-62.

6Harirchi I,Kolahdoozan S,Karbakhsh M,etal.Twenty years of breast cancer in Iran:downstaging without a formal screening program〔J〕.Ann Oncol,2011;22(1):93-7.

7Parkin DM,Bray F,Ferlay J,etal.Global cancer statistics,2002〔J〕.CA Cancer J Clin,2005;55(2):74-108.

8Bonaccorsi I,Cantoni C,Carrega P,etal.The immune inhibitory receptor LAIR-1 is highly expressed by plasmacytoid dendritic cells and acts complementary with NKp44 to control IFNα production〔J〕.PLoS One,2010;5(11):e15080.

9Meyaard L.The inhibitory collagen receptor LAIR-1 (CD305)〔J〕.J Leukoc Biol,2008;83(4):799-803.

10Tang X,Tian L,Esteso G,etal.Leukocyte-associated Ig-like receptor-1-deficient mice have an altered immune cell phenotype〔J〕.J Immunol,2012;188(2):548-58.

11薛江楠，王春艳，张晓姝，等.肿瘤患者外周血中抑制性受体LAIR-1表达升高〔J〕.细胞与分子免疫学杂志，2008;24(4)：373-4.

〔2015-03-11修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)