转染T-bet鼻咽癌细胞肿瘤疫苗的体外抗肿瘤效应中干扰素-γ的表达

曾友根朱欠元李宝金1

(井冈山大学临床医学院耳鼻喉科，江西吉安343000)

摘要〔〕目的研究转染T-bet鼻咽癌细胞肿瘤疫苗的体外抗肿瘤效果。方法构建转染T-bet鼻咽癌细胞肿瘤疫苗，体外培养鼻咽癌患者的外周血淋巴细胞，用肿瘤疫苗刺激后ELISA检测上清中细胞因子干扰素(IFN)-γ的分泌量。结果淋巴细胞+TCV-T-bet组细胞因IFN-γ的含量24 h、48 h、72 h与淋巴细胞+培养液组及淋巴细胞+TCV-CNE-2组相比差异显著(P<0.01)。结论表达T-bet基因的人鼻咽癌细胞CNE-2肿瘤疫苗在体外能够诱导有效的抗肿瘤免疫反应。

关键词〔〕T-bet基因；干扰素-γ；肿瘤疫苗

中图分类号〔〕R739.63〔文献标识码〕A〔

基金项目：江西省自然科学基金资助项目(2010GZY0192)

通讯作者：朱欠元(1967-)，男，教授，主任医师，主要从事耳鼻咽喉疾病研究。

1广州市第八人民医院普通外科

第一作者：曾友根(1980-)，男，主治医师，讲师，主要从事耳鼻咽喉疾病研究。

肿瘤患者体内的抗肿瘤免疫是处于抑制状态，Th2型免疫强而Th1型免疫弱，因此目前研究热点是促进抗肿瘤的Th1型细胞免疫〔1〕。T-bet是Th1特异性的转录因子，在Th1细胞的分化中起着关键作用。本文克隆T-bet基因，构建含能表达T-bet基因的人鼻咽癌细胞CNE-2肿瘤疫苗，通过肿瘤疫苗的体外抗肿瘤效应，检测外周血中Th1的特征性细胞因子IFN-γ的表达情况，研究T-bet调控Th1优势分化的作用。

1材料和方法

1.1主要试剂主要试剂胎牛血清、DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶购自HyClone；淋巴细胞分离液、干扰素(IFN)-γ试剂盒、十四酸佛波酯(PMA)、离子霉素购自美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1转染T-bet鼻咽癌细胞肿瘤疫苗构建BglⅡ+SalⅠ双酶切质粒pMD18-T-bet，通过琼脂糖电泳切胶回收T-bet基因片段，将T-bet基因片段克隆入pEGFP-C1的相同酶切位点，然后进行鉴定。大量提取质粒，冻存于-20℃中备用，用于转染细胞。 转染前1 d，用0.25%胰蛋白酶消化 鼻咽癌CNE-2细胞并计数，将细胞铺于6孔板中，按(2.5～10)×105个细胞/孔，待细胞长至50%融合时进行转染。重组质粒pEGFP-C1-T-bet和空质粒pEGFP-C1用前于4℃下15 000 r/min离心10 min，取250 μl无血清DMEM培养基分别稀释4 μg重组质粒pEGFP-C1-T-bet和空质粒pEGFP-C1，混匀并置室温下孵育15 min。同时取240 μl无血清DMEM培养基稀释10 μl LipofectamineTM2000，室温下孵育5 min。混合稀释的LipofectamineTM 2000和稀释的质粒DNA，室温孵育20 min。加入上述混合液500 μl，轻轻混匀后置37℃、5%CO2孵箱培养5 h。5 h以后吸去含质粒DNA的培养基，加入含10%胎牛血清的DMEM新鲜培养基2 ml，置5%CO2、37℃、孵箱培养，24 h后在荧光显微镜下观察细胞转染效率。转染48 h后加G418 (600 μg/ml)进行T-bet阳性细胞筛选，筛选14 d后挑取G418抗性单克隆到12孔板中继续培养。长到足够的数量时，提取其总RNA，RT-PCR检测T-bet基因的表达。将转染T-bet鼻咽癌细胞肿瘤疫苗用丝裂霉素C处理后制成瘤苗TCV-T-bet(TCV tumour cell vaccine 肿瘤细胞疫苗)。

1.2.2鼻咽癌病人外周血淋巴细胞(PBL)的制备取鼻咽癌患者肝素抗凝静脉血20 ml，离心分离外周血单个核细胞(PBMC)，制备单细胞悬液，洗涤置细胞培养瓶中培养2 h，取悬浮细胞，即为淋巴细胞。

1.2.3鼻咽癌病人PBL与肿瘤疫苗的共培养上清中细胞因子检测鼻咽癌病人PBL与肿瘤疫苗的共培养：将PBL按1×1010/L调整细胞浓度铺于6孔板中，在含有PMA 和离子霉素10%胎牛血清的RPMI 1640条件下培养6 h。分成3组，分别加入培养液、TCV-CNE-2和TCV-T-bet。调整瘤苗浓度使瘤苗和淋巴细胞的比例达到1∶20，每组设3个复孔。放入5%CO2、37℃、孵箱中培养24 h，离心收集上清液，ELISA检测IFN-γ的分泌量，继续收集培养48和72 h上清液，ELISA再次检测。

1.3统计学处理采用SPSS10.0行t检验。

2结果

2.1T-bet的RT-PCR扩增PCR产物电泳结果表明，扩增产物的大小约1 608 bp，与预计T-bet cDNA的大小一致(图1)。

图1　RT-PCR扩增T-bet基因全长序列

2.2T-bet转染用脂质体2000细胞转染试剂盒把重组表达载体pEGFP-C1-T-bet转入人鼻咽癌细胞株CNE-2中，用荧光在10×20倍倒置显微镜下观察细胞，统计绿色荧光细胞，转染效率为78%。同时与未转染质粒的鼻咽癌细胞CNE-2作对照(图2)。

A.未转染pEGFP-C1-T-bet载体时(普通光下)；B.转染pEGFP-C1-T-bet载体后 (荧光下) 图2　CNE-2转染及未转染pEGFP-C1-T-bet载体在 倒置显微镜下的表现(×200)

2.3ELISA检测人PBL与肿瘤疫苗的共培养上清中IFN-γ的分泌量淋巴细胞+TCV-T-bet组共培养上清中IFN-γ的含量24、48、72 h分别为(28.13±3.42)μg/L、(26.23±4.10)μg/L、(25.83±5.67)μg/L；与淋巴细胞+培养液组24、48、72 h为(0.17±0.11)μg/L、(0.22±0.10)μg/L、(0.15±0.08)μg/L及淋巴细胞+TCV-CNE-2组24、48、72 h为(0.22±0.13)μg/L、(0.25±0.17)μg/L、(0.24±0.18)μg/L相比，差异显著(P<0.01)。

3讨论

肿瘤疫苗是近年研究的热点之一，其作用原理是通过激活自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤细胞。基因修饰的肿瘤细胞能使机体产生特异性免疫反应，毒性最小。本研究从外周血中分离出淋巴细胞，扩增T-bet分子基因片段，酶切后构建入pEGFP-C1真核表达载体中，通过该载体转染到人鼻咽癌细胞株CNE-2中，制备转染了基因的鼻咽癌细胞肿瘤疫苗。一方面通过基因调控可以改变患者细胞因子优势状态，从而刺激机体的抗肿瘤细胞免疫；另外利用鼻咽癌细胞疫苗含有特异性的、具有免疫原性的肿瘤抗原，可以增强其识别鼻咽癌患者体内癌细胞的能力，从而激活淋巴细胞，产生有效的抗癌免疫反应。

Th1/Th2分化失衡是机体免疫应答调节的关键环节。近来研究〔2，3〕发现肿瘤患者体内免疫失衡出现Th1/Th2的偏移，Th1因子如IFN-γ明显降低，IL-4、IL-10等Th2型细胞因子明显增多与恶性肿瘤的发生、发展、治疗和转归有密切的关系。因此促进抗肿瘤的Th1型细胞免疫是一个研究热点〔4～6〕。T-bet基因是Th1特异性的转录因子，可调控Th1细胞分化。本文克隆T-bet基因，构建含能表达T-bet基因的人鼻咽癌细胞CNE-2瘤苗。使患者外周血CD4+Th细胞原来的Th2极化型转变为Th1极化型，增加Th1细胞的数量，恢复Th1/Th2平衡。本试验说明瘤苗作用于淋巴细胞，可诱导Th1型细胞强烈表达IFN-γ。人鼻咽癌细胞T-bet肿瘤疫苗体外有效的抗肿瘤作用，有望为肿瘤的治疗开辟一条新的途径。但体内体外作用的具体机制和通路有待于进一步探讨。

4参考文献

1Afkarian M，Sedy JR，Yang J，etal.T-bet is a STAT-1 induced regulator of IL-12R expression in naive CD4+T cells〔J〕.Nat Immunol，2002；3(6)：549-57.

2Tzankov A，Meier C，Hirschmann P，etal.Correlation of high numbers of intratumoral FOXP3+%regulatory T cells with improved survival in germinal center-Like diffuse large B-cell lymphoma，follicular lymphoma and classical Hodgkin′s lymphoma〔J〕.Haematologica，2008;93(2)：193-200.

3Placek K，Gasparian S，Coffre M，etal.Integration of distinct intracellular signaling pathways distal regulatory elements directs T-bet expression inhuman CD4+T cells〔J〕.Immunology，2009;183(12)：7743-51.

4李亚男，周玉峰，方峰，等.MCMV感染对小鼠脾细胞调节性T细胞比率和Th1/Th2转录因子T-bet/GATA3表达的影响〔J〕.中华医学杂志，2008;88(42)：2999-3002.

5刘加洪，王英年，赵云峰，等.Th1-Th2平衡失调与人类疾病关系及其相关治疗研究现状〔J〕.青岛大学医学院学报，2002;38(4)：366-8.

6韩根成，沈倍奋.Th17细胞分化，调节及效应研究进展〔J〕.生物化学与生物物理进展，2008;35(2)：117-23.

〔2014-04-21修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)