段静静， 郭文斌，张 弛， 王媛媛，宫 婷， 宋存江*

(1.厦门大学 环境与生态学院， 福建 厦门 361102；2.南开大学 生命科学学院，天津 300071)



门多萨假单胞菌NK-01合成中长链聚羟基脂肪酸酯的发酵条件优化

段静静1，2， 郭文斌2，张 弛2， 王媛媛2，宫 婷2， 宋存江2*

(1.厦门大学 环境与生态学院， 福建 厦门 361102；2.南开大学 生命科学学院，天津 300071)

为了提高PHAMCL在门多萨假单胞菌NK-01中的积累，采用单因素实验和正交实验确立了发酵生产PHAMCL的最佳条件，即以PHA产量为指标的最佳发酵条件为15 g/L葡萄糖浓度、C/N=50、发酵时间48 h，该条件下获得产量0.8 g/L以上的PHA；以PHA占菌体干重百分含量为指标的最佳发酵条件为10 g/L葡萄糖浓度、C/N=60、发酵时间48 h，该条件下获得占菌体干重50%以上的PHA。该研究将为门多萨假单胞菌NK-01用于PHAMCL的规模化生产提供理论依据。

门多萨假单胞菌；聚羟基脂肪酸酯；正交实验

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类微生物在环境条件不平衡的条件下，如碳源过量氮源不足的情况下积累在体内的能源或碳源物质。据报道已有300余种微生物能够积累PHA[1-2]。除了纯菌发酵外，活性污泥法也被用于PHA的发酵生产[3]。根据PHA单体碳原子数的多少，可划分为短链PHA(PHASCL)和中长链PHA(PHAMCL)[4]。前者的组成单体碳原子在3～5个，而后者为6～16个。早在1926年，PHASCL就已经在巨大芽胞杆菌中被发现[5]，而直到1983年PHAMCL才被发现、报道[6]。PHAMCL除了和PHASCL一样具有可降解性和生物相容性外，还具有诸多PHASCL所不具有的优良性质，如较高的黏弹性和较高的断裂伸长等。基于这些优良的性能，PHAMCL在组织工程中有广泛的应用[7]，如PHAMCL可通过静电纺丝用于组织工程血管支架材料等[8]。PHAMCL已经引起了科学界和工业界的广泛关注[9]。门多萨假单胞菌NK-01分离自天津市西青区农田土壤中[10]，能够合成PHAMCL，其单体主要组成为3-羟基辛酸酯(3-HO)和3-羟基癸酸酯(3-HD)[11]。此外，其具有300%的断裂伸长率和高达300 ℃的热分解温度，因此具有广泛的应用前景[11]。本研究试图通过单因素和正交实验相结合的方法，探索门多萨假单胞菌NK-01发酵生产PHAMCL的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina) NK-01分离自天津市西青区农田土壤中，并保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 208005。

1.1.2 培养基(g/L) ①LB培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH值7.0～7.2。LB固体培养基即LB液体培养基中加入1.5%的琼脂。②发酵培养基：Na2HPO43.8，KH2PO42.65，MgSO40.2，微量元素液1 mL/L(微量元素液：0.1 mol/L HCl 1 000 mL，CoCl2·6H2O 0.218 g，CaCl27.8 g，CrCl3·6H2O 0.105 g，NiCl20.118 g，CuSO4·5H2O 0.156 g，FeCl39.7 g)，根据不同的发酵实验加入相应量的葡萄糖和NH4Cl，调pH为7.0。③磷酸盐缓冲液：Na2HPO4·12H2O 8.95，KH2PO41.5，pH 为7.0。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 ①种子培养：从菌种活化的LB固体平板上挑取单菌落接入含有5 mL LB液体培养基的试管中，30 ℃，150 r/min培养过夜。以1%接种至含有150 mL LB液体培养基的500 mL三角瓶中，培养至OD600=1.3，8 000 r/min离心10 min，弃上清液，用18 mL磷酸盐缓冲溶液悬浮菌体作为接种物。②碳源浓度作为单因素的发酵实验：发酵培养基中葡萄糖含量分别为5、10、15、20、25、30 g/L，相应的NH4Cl含量为0.149、0.296、0.444、0.593、0.742、0.891 g/L，此时的碳氮比值为60。以1 mL接种物接种于150 mL发酵培养基中，30 ℃，150 r/min培养48 h。③碳氮比作为单因素的发酵实验：发酵培养基中葡萄糖含量为15 g/L，NH4Cl含量分别为0.888、0.666、0.533、0.444、0.381、0.333 g/L，此时相应的碳氮比值为30、40、50、60、70、80。以1 mL接种物接种于含150 mL发酵培养基中，30 ℃，150 r/min培养48 h。④发酵时间作为单因素的发酵实验：发酵培养基中葡萄糖含量为15 g/L，NH4Cl 含量为0.381 g/L，此时相应的碳氮比值为70。以1 mL接种物接种于含150 mL发酵培养基中，30 ℃，150 r/min，培养时间分别为42、48、54、60、66、72 h。⑤正交设计实验发酵培养：选择单因素实验中较优的3个水平，即葡萄糖浓度分别为10、15、20 g/L，碳氮比值分别为50、60、70，发酵时间分别为48、54、60 h进行正交实验。选择L9(34)正交表，2个单位组，共18个实验，每个实验3个平行。

1.2.2 PHAMCL的提取 发酵结束后，离心收集菌体，无菌水洗涤，冷冻干燥，称重。每克干菌体加入50 mL的氯仿室温下抽提48 h，用定性滤纸过滤除去残渣，滤液浓缩后加入40倍体积的冷甲醇进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，称重。

2 结果与分析

2.1 碳源浓度对PHA产量和PHA占菌体干重百分比的影响

图1显示出碳源浓度对PHA产量和百分比的影响，当碳源浓度从5 g/L增加到30 g/L时，PHA产量从0.325 g/L增加到0.732 g/L，随后又降至0.382 g/L；而当碳源浓度从5 g/L增加到30 g/L时，PHA占菌体干重的百分比呈递减趋势，从占菌体干重的40.8%一直下降到11.0%。综合考虑PHA产量和PHA百分比两方面的因素，选取10、15、20 g/L的葡萄糖浓度进一步进行正交试验。

图1 碳源浓度对PHA产量和PHA占菌体干重百分比的影响Fig.1 The impact of carbon concentration on PHA yield and PHA content

2.2 碳氮比对PHA产量和PHA占菌体干重百分比的影响

当碳氮比值从30增加至80时对PHA产量的影响不大，PHA产量在0.530～0.740 g/L(图2)，碳氮比值为70时PHA产量最高，为0.740 g/L。碳氮比的改变对PHA百分含量的影响较大，当碳氮比值在30～80时，PHA百分含量在21.96%～38.45%之间；当碳氮比值为70时PHA百分含量最高，为38.45%。选取碳氮比值为50、60、70进行正交试验。

2.3 发酵时间对PHA产量和PHA占菌体干重百分比的影响

图2 碳氮比对PHA产量和PHA占菌体干重百分比的影响Fig.2 The impact of carbon nitrogen ratio on PHA yield and PHA content

如图3所示，发酵时间在48～66 h时PHA产量和PHA占菌体干重百分比都维持在较高的水平，66 h时产量最高为0.763 g/L，48 h时百分含量最高为42.70%。综合考虑PHA产量和PHA百分含量2个因素，选取发酵时间为48、54、60 h进行正交试验。

图3 发酵时间对PHA产量和PHA占菌体干重百分比的影响Fig.3 The impact of fermentation time on PHA yield and PHA content

2.4 以PHA产量为指标的正交实验

2.4.1 正交实验结果 选择单因素实验中较优的3个水平，即葡萄糖质量浓度分别为10、15、20 g/L，碳氮比值分别为50、60、70，发酵时间分别为48、54、60 h进行正交实验。选择L9(34)正交表，2个单位组，共18个试验，每个单位组3个平行。试验表征指标为PHA产量，正交试验结果如表1所示。

表1 以PHA产量为指标的正交实验结果

续表1

2.4.2 方差分析 方差分析见表2。首先检验MSe1与MSe2差异的显著性，若经F检验不显著，则可将其平方和与自由度分别合并，计算出合并的误差均方，进行F检验与多重比较，以提高分析的精度；若F检验显著，说明存在交互作用，二者不能合并，此时只能以MSe2进行F检验与多重比较。本试验中，MSe1/MSe2<1，MSe1与MSe2差异不显著，故将误差平方和与自由度分别合并计算出合并的误差均方MSe，即MSe=(SSe1+SSe2)/(dfe1+dfe2)=(0.024 4+0.097 8)/(2+8)=0.012 22。F检验结果表明，3个因素对PHA 产量的影响均不显著。由于各因素对PHA产量影响都不显著，不必再进行各因素水平间的多重比较。此时，可以直观地从表1中选择平均数大的水平组成最优的水平组合，即15 g/L的葡萄糖浓度、C/N=50、48 h的发酵时间。重复实验表明，在该条件下PHA产量为0.8 g/L以上。

表2 以PHA产量为指标的正交实验方差分析

注：MS：均方；SS：平方和；df：自由度；MS=SS/df。F：差异显著性；F= MSi/MSe；表4同

2.5 以PHA占菌体干重百分比为指标的正交实验

2.5.1 正交实验结果 正交试验结果如表3所示。选择L9(34)正交表，试验因素水平与表1相同，试验表征指标为PHA占细胞干重百分比。

2.5.2 方差分析 方差分析见表4。如表4所示，Mse1/Mse2<1，Mse1与Mse2差异不显著，故将误差平方和与自由度分别合并计算出合并的误差均方MSe，即Mse=(SSe1+SSe2)/(dfe1+dfe2)=(21.72+258.94)/(2+8)=28.07。F检验结果表明，碳源浓度对PHA 百分含量的影响极显著，另外两个因素作用不显著，2个单位组间差异不显著。进一步列表对碳源浓度的3个水平进行多重比较，结果见表5。因为碳氮比和发酵时间因素水平间差异均不显著，从表3选择碳氮比和发酵时间因素使PHA百分含量达到最高的水平，即：C/N=60及发酵时间48 h。

表3 以PHA百分含量为指标的正交实验结果

表4 以PHA百分含量为指标的正交实验方差分析表

注：**表示极显著；MS，均方；SS，平方和；df，自由度；MS = SS/df；F，差异显著性；F = MSi/MSe

2.5.3 碳源质量浓度的3个水平多重比较 采用最小显著法-LSD法，结果如表5所示，P值小于0.5，3个检验均拒绝假设(第1水平的均值与第3水平的均值相等，第2水平的均值与第3水平的均值相等，第1水平的均值与第2水平的均值相等)。说明3个都有差异性，但是第1水平与另2个差别更大。本试验因模型误差不显著，可以认为因素间不存在显著的交互作用。可由3个因素的最优水平组成最优水平组合。多重比较确定碳源浓度因素的最优水平为10 g/L。方差分析确定的C/N=60及发酵时间48 h为最优水平。重复试验表明，在该条件下PHA百分含量达到50%以上。

表5 碳源浓度各水平平均数多重比较表

注：**表示极显著

3 讨 论

考察碳源浓度对PHA产量和PHA占菌体干重百分比的影响时，虽然葡萄糖浓度在5 g/L时PHA的百分含量最高，达到40.8%，但是此时的PHA产量却很低，只有0.325 g/L。为了兼顾二者，选择碳源质量浓度为10、15、20 g/L3个水平进行进一步正交试验。

PHA产量和PHA占菌体百分比是衡量PHA发酵条件优劣的2个重要指标，PHA属胞内脂溶性聚合物，发酵结束后还要经过有机溶剂抽提、旋转蒸发等步骤才能得到纯的PHA，因此PHA百分含量势必影响PHA纯化成本的高低，故在条件优化中把PHA产量和PHA百分含量作为指标对发酵条件进行考察。

经优化后门多萨假单胞菌NK-01生产PHA百分含量虽然只有50%，但是仍然高于一些土壤分离菌株的发酵水平，如王丹等[2]报道了土壤分离菌株发酵生产PHA最高百分含量为19.25%，此时最高产量达0.7 g/L。恶臭假单胞菌KT2440是研究PHAMCL合成的一株重要菌株，2002年Hein S等[12]报道了恶臭假单胞菌KT2440以葡萄糖酸为底物合成占菌体干重34.6%的PHA。2009年， Cai L等[13]报道了恶臭假单胞菌KT2442在以10 g/L的辛酸为底物能够合成占菌体干重66.21%的PHA，此时菌体干重为2.82 g/L，因此PHA产量为1.87 g/L。恶臭假单胞菌KT2442是KT2440的突变株，具有利福平抗性[14]。优化后门多萨假单胞菌NK-01生产PHA百分含量高于恶臭假单胞菌KT2440而略低于恶臭假单胞菌KT2442，而门多萨假单胞菌NK-01生产PHA优化后的产量(0.8 g/L)高于王丹等[2]报道的土壤分离菌株的发酵水平，低于恶臭假单胞菌KT2442的发酵水平。

经过发酵条件优化后，门多萨假单胞菌NK-01合成PHAMCL的能力仍然不是很高。究其原因主要有两点:一是高浓度的葡萄糖抑制PHA产量的增加，因此可以考虑采用补料分批发酵方式来合成PHA；二是由于碳源除了用于PHA的合成，更多地流向了褐藻寡糖的合成，使得PHA的产量不高。在假单胞菌中合成PHAMCL的途径已经非常清楚[15]，当以葡萄糖为碳源时是以脂肪酸从头合成途径来合成PHA，即葡萄糖经过几步反应后生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入脂肪酸从头合成途径生成R-3-羟基脂酰ACP，再经过PHA合成途径的2个关键酶phaG和phaC1/phaC2的作用合成PHA。而在门多萨假单胞菌NK-01中，褐藻寡糖的合成可以竞争性地利用乙酰辅酶A[11]。已经证实，门多萨假单胞菌NK-01敲除掉PHA合成操纵子基因的突变株可以显著地提高褐藻寡糖的产量[16]。恶臭假单胞菌KT2442通过代谢改造敲除掉PHA降解酶基因phaZ的突变株KTMQ01合成PHA的百分含量能够高达86.47%，比野生菌提高了20%[13]。因此，可以通过基因工程的办法获得褐藻寡糖合成缺陷菌株，使得碳源更多地流向PHA的合成，提高门多萨假单胞菌NK-01合成PHAMCL的产量和百分含量。

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Optimization of Fermentation Conditions for Medium-Chain-Length Polyhydroxylalkanoate Synthesis by Pseudomonas mendocina NK-01

DUAN Jing-jing1, 2, GUO Wen-bin2, ZHANG Chi2, WANG Yuan-yuan2, GONG Ting2,SONG Cun-jiang2

(1.Coll.ofEnviron't&Ecol.,XiamenUni.,Xiamen361102; 2.Coll.oflifeSci.,NankaiUni.,Tianjin300071)

In order to improve the accumulation of PHAMCLinvivo, single factor and orthogonal experiments were adopted to study the optimization fermentation conditions forPseudomonasmendocinaNK-01. When PHAMCLoutput was taken as an index, under optimized fermentation conditions at 15 g/L glucose, with C/N ratio at 50 and fermented for 48 h, produced over 0.8/L of PHAMCL. When the index was turned to PHAMCLpercentage content of dried cell weight (DCW), the best fermentation conditions were 10 g/L glucose, with C/N ratio at 60 and fermented for 48 h, the PHAMCLoutput was over 50% of DCW. This study will provide theoretic foundations for large scale production of PHAMCLbyP.mendocinaNK-01.

Pseudomonasmendocina；polyhydroxyalkanoate；orthogonal experiment

国家自然科学基金项目(31070039)

段静静 女，工程师，博士。从事环境微生物相关研究。Tel: 0592-2880204，E-mail: duanjingjing@xmu.edu.cn

* 通讯作者。男，教授，博士生导师。研究方向为资源微生物。Tel: 022-23503866，E-mail: songcj@nankai.edu.cn

2014-09-06；

2014-11-19

文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2015)04-0048-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.009