王丽宁， 赵 妍， 陈明杰*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2. 上海市农业科学院食用菌研究所上海市农业遗传育种重点开放实验室 农业部南方食用菌资源利用重点实验室 国家食用菌工程技术研究中心，上海 201403)



香菇单孢杂交及耐高温杂交子的ISSR分析

王丽宁1, 2， 赵 妍2*， 陈明杰1, 2*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2. 上海市农业科学院食用菌研究所上海市农业遗传育种重点开放实验室 农业部南方食用菌资源利用重点实验室 国家食用菌工程技术研究中心，上海 201403)

以香菇菌株L135和P18N44为亲本进行单孢杂交，通过显微镜镜检锁状联合以及与亲本的拮抗试验初步获得123个杂交子。以47 ℃热激3 h后菌丝在PDA培养基中的恢复生长情况进行初筛，菌丝在木屑培养基中经历33 ℃高温后的恢复长速进行复筛，共筛选获得耐高温杂交子12个。选用8条引物对12个耐高温杂交子和2个亲本进行了ISSR标记分析，结果表明这12株耐高温杂交子与亲本都存在一定的遗传差异，说明与亲本相比杂交子在基因水平上发生了不同程度的重组，是新的香菇耐高温菌株。

香菇；单孢杂交；耐高温；ISSR分析

香菇(Lentinulaedodes)又名香蕈、香信、冬菇等，隶属于伞菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、香菇属(Lentinula)。香菇具有较高的营养价值和药用功效，其精氨酸、赖氨酸含量丰富，有很好的增智健脑作用；香菇多糖则具有抗肿瘤的作用。因此，香菇素有“菇中之王”的美称[1]。香菇属中低温型食用菌，自然条件下其菌丝的最适生长温度为24～27 ℃，子实体发生的最适温度为15～20 ℃[2]。由于夏季鲜香菇价格高、效益好，其栽培量逐年增长，但香菇菌筒在越夏过程中很难经受持续高温的考验，烂筒现象严重，严重影响产量[3]，因此随着香菇栽培区域的不断扩大，以及满足香菇夏季生产的需要，生产者对耐高温且优质香菇新品种的需求也越来越大。近年来香菇耐高温菌种的选育取得了一定的进展，福建三明市真菌研究所以香菇95为出发菌株，用常规人工选择育种方式育成的高温品种L18抗性强、品质好，适宜在我国大部分地区进行反季节覆土栽培[4]；张忠伟等[5]以长白山野生香菇菌株野香3号和生产用品种L66为亲本进行单孢杂交，经4年出菇试验、产比试验和生产试验选育得到的杂交菌株抚香2号出菇期耐高温，且农艺性状优良；丽水市大山菇业研究开发有限公司，通过自选分离得到了菇形和菇质优良的高温型香菇菌株L9319，目前已成为国内夏季鲜香菇生产区的主栽品种[6]。但耐高温香菇的品种仍然相对单一，生产实践中需要更多优质的耐高温香菇新品种。目前，国内香菇新品种选育应用最普遍的方法为杂交育种[7-8]，该方法操作简便、成功率高。本研究以农艺性状优良的菌株L135与耐高温的诱变菌株P18N44为亲本，借助单孢杂交方法获得了一批耐高温的杂交子，并运用ISSR(Inter-simple Sequence Repeat，简单重复序列间隔区标记技术)对杂交子的遗传多样性进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 香菇菌株L135，由上海市农业科学院食用菌研究所菌种保藏中心提供；P18N44为本实验室保藏菌种(香菇菌株P18的耐高温诱变菌株)。

1.1.2 主要仪器和试剂 智能食用菌培养箱(ZJX-300A，杭州钱江仪器设备有限公司)；洁净工作台(VS-1300L-U，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；显微镜(BX60，奥林巴斯光学有限公司)；PCR仪(Veriti，基因有限公司)；电泳槽(DYY-6C，北京市六一仪器厂)；凝胶成像分析系统(美国柯达公司)；TaqDNA polymerase、dNTPs MIX、10×buffer(宝生物工程(大连)有限公司)；Primer(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.1.3 培养基 PDA培养基(g/L)：马铃薯提取物200，葡萄糖20，琼脂20，加蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌15 min；PDY培养基(g/L)：马铃薯提取物200，葡萄糖20，酵母提取物2，加蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌15 min；木屑培养基：杂木屑78%，麦麸20%，糖1%，石膏1%，料水比1∶1.2～1.3，pH自然，121 ℃灭菌150 min。

1.2 方法

1.2.1 亲本单孢菌丝分离 在亲本栽培出菇后，选择菇形圆整、开伞程度七八分的2个亲本子实体，在无菌环境下分别收集其孢子，对收集到的孢子进行单孢分离[9]，然后涂布于PDA平板上，待孢子萌发后，在显微镜下观察，3次镜检无锁状联合的则判定为单孢菌丝，转管扩繁备用。

1.2.2 配对杂交及杂交子的检测 在25 ℃下，将L135的孢子单核体与P18N44的孢子单核体于PDA平板上相聚2 cm进行对峙培养，待两单孢菌落边缘菌丝彼此接触3～4 d后，挑取菌落相交处的菌丝进行转接。将转接的菌丝用于显微镜镜检以及与两亲本的拮抗试验[10]，有锁状联合且与两亲本发生拮抗的则初步视为杂交子。

1.2.3 耐高温杂交子的初筛 对亲本菌株L135与P18N44进行高温耐受性试验，首先将L135与P18N44的平板菌丝用0.5 mm的打孔器打孔后，接种于PDA平板上(各5个平行)，4 d后用记号笔划出菌丝生长范围，然后置于47 ℃培养箱中热激处理3 h。热处理后的平板转移至25 ℃培养箱中继续培养，观察并记录两亲本热激后菌丝恢复生长的情况，以确定两亲本47 ℃热激3 h后菌丝能够恢复生长的天数，并以此为筛选标准对杂交子进行初筛，杂交子中热激3 h后比亲本恢复快的则初步视为耐高温杂交子[11-12]。

1.2.4 耐高温杂交子的复筛 将1.2.3中筛选到的杂交子于PDA平板上培养5～7 d，用直径为1 cm的打孔器打孔后，接入装有木屑培养基的大试管(30 mm×200 mm)中，每个杂交子接5支试管，置于25 ℃培养，待菌丝延伸至木屑中且长势稳定时(大约15 d)，将大试管置于33 ℃的培养箱中培养7 d，用记号笔划线作为起始标志，继续将大试管置于25 ℃培养箱中进行培养，用记号笔记录10 d内菌丝的生长范围，计算各杂交子经历33 ℃高温后菌丝的恢复生长速度用以作为复筛的标准，淘汰恢复长速过慢的杂交子，剩余杂交子用于后续试验。

1.2.5 ISSR-PCR分析 将1.2.4得到的杂交子与亲本菌株进行液体培养，收集菌丝后用CTAB法提取基因组DNA[13]。ISSR-PCR反应：反应体系为20 μL，其中10×buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 1 μL、10 μmol/L Primer 1 μL、5 U/μLTaqDNA Polymerase 0.2 μL，ddH2O补齐至20 μL。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃保持7 min；4 ℃保存。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，在紫外光下观察并照相。以亲本L135与P18N44的基因组DNA为模板，对16条ISSR引物(表1)进行扩增，选出能够清晰、稳定地扩增出两亲本条带的引物，再用筛选得到的引物对杂交子和亲本进行ISSR-PCR反应，记录电泳条带谱图，并利用软件NTsys 2.10e构建聚类树状图[14-16]。

表1 供试ISSR引物及序列

注：S=(C/G), B=(C/G/T), D=(A/G/T)

2 结果与分析

2.1 单孢分离及配对杂交

图1 杂交子84的锁状联合(A图中箭头所示)以及84与亲本的拮抗反应(B)Fig.1 Clamp connection of hybrid 84 (A indicated by the arrows) and its antagonism reaction with two parents (B)

试验共得到L135单孢菌株62株，P18N44单孢菌株19株，两亲本单孢菌株随机配对208个组合。经显微镜镜检及拮抗试验，有锁状联合且与亲本产生拮抗的菌株共123株，即初步得到杂交菌株123株，杂交子的锁状联合及与亲本的拮抗反应如图1所示。

2.2 耐高温杂交子的初筛

根据实验室前期的研究基础[11-12]，对亲本菌株L135与P18N44进行高温耐受性试验。L135于47 ℃热激3 h后重新置于25 ℃，菌丝经7～10 d后能够恢复生长；P18N44于47 ℃热激3 h后菌丝经5～7 d能够恢复生长。因此以47 ℃热激3 h后菌丝的恢复生长天数少于5 d为标准对2.1中的123株杂交子进行筛选(图2)，初步筛选得到耐高温杂交子共17株，分别编号为72～88，这17株杂交子于47 ℃热激3 h后菌丝的恢复生长天数都少于5 d，表现出了较强的恢复能力，即其耐高温能力较亲本强。

图2 菌丝于47 ℃热激3 h后恢复生长6 d的情况Fig.2 The recover ability of mycelia after being treated at 47 ℃ for 3 h

2.3 耐高温杂交子的复筛

王丽宁等[11]的研究表明，经历高温后木屑培养基中菌丝恢复长速快的菌株出菇性状相对较好，又因为香菇菌丝在34 ℃时即会停止生长[2]，因此本研究测定了2.2中17个杂交子及2个亲本在木屑培养基中经历33 ℃高温后的恢复长速。计算各菌株的恢复长速(各5个平行)，并统计恢复长速较快的杂交子(表2)，从统计结果中可以看出，共有12个杂交子(编号分别为74、75、76、77、79、80、81、82、83、84、85、86)表现出了较快的恢复长速，初步判断这12个杂交子为真正的耐高温杂交子，适合用于后续的ISSR分析。

表2 亲本及杂交子在木屑培养基中的恢复长速

2.4 ISSR标记分析

借助2个亲本菌株对16条ISSR引物进行筛选，最后得到8条适用引物(ISSR1、ISSR9、ISSR10、ISSR11、ISSR12、ISSR19、ISSR20、ISSR25)，用筛选得到的引物对12个耐高温杂交子与亲本一起进行ISSR扩增(引物ISSR19的ISSR-PCR扩增电泳图谱如图3所示)。8条引物共扩增出67个条带，片段大小在200～5 000 bp之间，各条引物扩增的条带数为6～10个，部分扩增片段是所有供试菌株所共有的，说明这些ISSR结合位点较为保守。依据上述8条ISSR引物的多态性数据，构建12个杂交子与2个亲本的UPMGA聚类树状图(图4)。聚类分析结果显示：14株香菇菌株间的遗传相似系数范围为0.58～0.87，在相似系数为0.64时分为3个类群。第Ⅰ类群在相似系数为0.65时又分为2个亚群，第1亚群包括杂交子74、75、82、85、86、83、84和P18N44，第2亚群包括79、80和L135；第Ⅱ类群包括76和77；第Ⅲ类群只包括杂交子81。杂交子与两亲本之间、杂交子之间都存在着一定的遗传差异。

图3 引物19的ISSR-PCR扩增电泳图谱Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of ISSR-PCR using primer 19

图4 ISSR聚类分析图谱Fig.4 Dendrogram of 14 strains based on ISSR-PCR reaction

3 讨 论

杂交育种是遗传物质在细胞水平上的重组，建立在双亲性状优势互补的基础上。杂交育种技术作为一种较为成熟的育种手段，广泛应用于香菇、平菇等多种食用菌的育种中，已获得多个优良品种和巨大的经济效益[5，7-9]。本试验以选育耐高温香菇新菌株为育种目标，采用L135和P18N44作为亲本进行单孢杂交，通过镜检锁状联合与拮抗试验初步获得123株杂交子。目的性状的筛选是育种的关键环节，菌丝耐高温是耐高温香菇菌株的首要条件。本研究通过菌丝在PDA中的47 ℃热激试验进行初筛，菌丝在木屑培养基中经历33 ℃高温后的恢复长速进行复筛，在比较菌丝的耐热性后，最终得到了12株耐高温杂交子。

与常规的锁状联合观察、亲本的拮抗试验不同，分子标记则是以生物个体间核苷酸的序列变异为基础的遗传标记，受外界环境的影响较小，且能更具体地表征杂交子与亲本之间的遗传信息差异[17]。ISSR作为一种常用的分子标记技术，目前已广泛应用于食用菌的种质鉴定和亲缘关系分析[14-16]。本试验选用条带清晰、重复性好的8条引物对12个耐高温杂交子与2个亲本进行了ISSR-PCR扩增反应，并对试验数据进行聚类分析，结果表明在相似系数为0.64时14个香菇菌株被分成3个类群，杂交子与亲本之间都存在着不同程度的遗传差异，说明与亲本相比杂交子在基因水平上发生了不同程度的重组，是杂交子作为新菌株的有力证据。

[1]宋春艳,陈明杰,谭琦.图说香菇栽培关键技术[M].北京:中国农业出版社, 2011: 1.

[2]黄年来.中国食药用菌学[M]. 上海: 上海科学技术文献出版社, 2010: 1244, 1247, 1250.

[3]蔡为明, 冯伟林, 金群力, 等.香菇热害烂筒调查及菌丝抗高温比较试验[J]. 食用菌学报, 2005, 12(1): 31-36.

[4]黄书文, 刘爱和, 吴建雄.香菇L18菌株特性及其栽培技术要点[J]. 食用菌, 2014,(1): 26-27.

[5]张忠伟, 姜涛, 魏立敏, 等.香菇杂交新品种抚香2号选育报告[J]. 食用菌, 2013,(1): 17-19.

[6]应国华, 吕明亮, 徐波, 等.L9319 香菇品种的主要特性及栽培技术[J]. 中国食用菌, 2011, 30(3): 63-64.

[7]王卓仁, 刘启燕, 肖扬, 等.香菇单孢杂交子代群体灰色关联度和ISSR分析[J]. 菌物学报, 2010, 29(2): 267-272.

[8]宋春艳, 刘德云, 章炉军, 等.香菇高产新品种“申香18号”[J]. 园艺学报, 2012, 39(6): 1219-1220.

[9]陈英南, 姜涛, 张忠伟.香菇单孢子杂交育种[J]. 特种经济动植物, 2008, 11(7): 46.

[10] 阮瑞国, 丁李春.适应松杉木屑栽培香菇新菌株宁香8 号菌丝拮抗性测定[J]. 江西农业学报, 2009, 21(6): 141-142.

[11] 王丽宁, 赵妍, 陈明杰, 等.利用原生质体紫外诱变技术选育耐高温香菇菌株[J].微生物学通报, 2014, 41(7): L1350-L1357.

[12] 王丽宁, 赵妍,张宝粉, 等. 原生质体紫外诱变选育香菇耐高温菌株[J]. 食品工业科技, 2014, 35(23)：171-174，181.

[13] 闫燕, 许文涛, 苏春元, 等. 平菇基因组DNA提取方法的研究[J]. 食品工业科技, 2011, 32(9): 190-193.

[14] 李莹, 李莉, 刘艳玲, 等. 杏鲍菇菌种遗传多态性的ISSR分析[J]. 微生物学杂志, 2014, 34(2): 24-28.

[15] 刘靖宇, 宋秀高, 叶夏, 等. 香菇菌株遗传多样性ISSR、RAPD和SRAP综合分析[J].食用菌学报, 2011, 18(3): 1-8.

[16] 周洁, 郭勇, 贾定洪, 等. 姬菇杂交菌株的ISSR分析[J]. 西南农业学报, 2009, 22(6): 1694-1698.

[17] 马富英, 罗信昌. 分子标记在食用蕈菌遗传育种中的应用[J]. 菌物系统, 2002, 21(1): 147-151.

Monospore Cross-Breeding of Xianggu Mushroom (Lentinula edodes) & ISSR Analysis of Thermo-Tolerant Hybrid

WANG Li-ning1, 2, ZHAO Yan2, CHEN Ming-jie1, 2

(1.Coll.ofFoodSci. &Tech,ShanghaiOceanUni,Shanghai201306; 2.Inst.ofEdibleFungiSAAS,KeyLab.exploitationofSouthernEdibleFungiRes.,Nat'lEngin.Res.Ctr.ofEdibleFungi,Shanghai210403)

Xianggumushroom (Lentinusedodes) strain L135 and P18N44 were taken as parents to carry out monospore cross-breeding. 123 hybrids were obtained initially after observing the existence of clamp connection through microscopic detection and the antagonism experiments with parents. Twelve thermo-tolerant hybrids were obtained after all the hybrids were screened through recover ability of mycelia in PDA after being treated at 47 ℃ for 3 h and mycelia growth rate in sawdust medium during recover process. Eight primers were chosen and used for ISSR mark analysis of 12 thermo-tolerant hybrids and two parents. The results showed that certain genetic differences existed between all these 12 thermo-tolerant hybrids and their parents, indicated that comparing to their parents there were different degree of recombination at gene level had occurred among the 12 thermo-tolerant hybrids, and they were all new thermo-tolerant strains.

xianggumushroom (Lentinulaedodes); monospore cross-breeding; thermo-tolerant; ISSR analysis

国家食用菌产业技术体系资助项目(CARS-24)

王丽宁 女，硕士研究生。研究方向为食药用菌遗传育种。E-mail:wanglining90@126.com

* 通讯作者。赵妍 女，博士，助理研究员。研究方向为食用菌遗传育种与生理生化。E-mail：jiandan289@126.com

2014-11-07；

2014-12-08

Q949.32

A

1005-7021(2015)04-0035-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.007

陈明杰 男，博士，研究员。研究方向为食用菌遗传育种与生理生化。E-mail：mjchen@saas.sh.cn