廖颖玲， 耿 宁， 金晓璐， 权春善,2*， 金黎明,2， 胡文忠,2

(1. 大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 116600； 2. 生物技术与资源利用国家民委-教育部重点实验室，辽宁 大连 116600)



以agr基因为靶点快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

廖颖玲1， 耿 宁1， 金晓璐1， 权春善1,2*， 金黎明1,2， 胡文忠1,2

(1. 大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 116600； 2. 生物技术与资源利用国家民委-教育部重点实验室，辽宁 大连 116600)

本文旨在建立一种以agr基因为靶点，快速检测金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。针对金黄色葡萄球菌附属基因调控基因agr序列，设计了4条特异性引物；优化了LAMP体系中甜菜碱、dNTP浓度、长短引物比等因素；通过对14株不同金黄色葡萄球菌菌株和4株其他常见食品致病菌株进行检测，评估引物特异性。结果表明，在Mg2+浓度为2.4 mmol/L，dNTP浓度为0.8 mmol/L，甜菜碱浓度为0.1 mol/L，长短引物比为1∶8，65 ℃反应50 min条件下扩增可达最佳效果。优化后的LAMP对14株金黄色葡萄球菌均表现为阳性，对4株非金黄色葡萄球菌菌株表现为阴性，证明引物具有特异性。本文首次利用agr基因作为靶基因片段，建立了一个简单、快速、特异性强的检测金黄色葡萄球菌的方法，在食品安全检测方面极具意义。

金黄色葡萄球菌；agr；环介导恒温扩增；快速检测

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)，是目前细菌性食物中毒和人类化脓性感染中最常见的病原体之一[1]，在自然界中分布极为广泛。据美国疾病控制中心报告，近年来由金黄色葡萄球菌引起的感染占细菌感染的第二位，仅次于大肠埃希菌。金黄色葡萄球菌对人类的危害极大，能够引起多种人体局部和全身感染，并且是一个非常重要的社区获得性和医院获得性病原菌[2]。由此可见，金黄色葡萄球菌污染已成为一个世界性的卫生问题，威胁着人类的健康和生命，迫切需要建立一种快速检测金黄色葡萄球菌的方法并及时预防处理。金黄色葡萄球菌的微生物病原特性非常复杂并且与大量的毒力因子有关，而这些毒力因子的表达受一个由许多基因位点组成的复杂网络所调控[3]。在这些基因中附属基因调节(accessory gene regulator，agr)系统在毒力基因的表达与调控中起决定作用，它也是唯一一个已知的通过群体感应机制调控的调节系统[4-5]。目前金黄色葡萄球菌快速检测方法包括传统的细菌分离鉴定、免疫检测[6]、PCR方法[7-9]、基因芯片(gene chip)等。细菌分离鉴定法操作繁琐、耗时长；免疫学方法如乳胶微粒凝集试验、ELISA等，可以缩短检测时间，但可能受到食物成分及葡萄球菌A蛋白的干扰[10]；而基因芯片方法其生化反应条件和过程不可控，反应效率较低，检测结果重复性较差。本文选用Notomi 等[11]报道的依赖于能够识别靶序列上 6 个特异区域的 4 条引物和一种具有链置换特性的DNA 聚合酶的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 技术，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增agr靶序列，达到快速检测食物中金黄色葡萄球菌的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠埃希菌(CMCC 44102)、副溶血弧菌(CGMCC 1.1616)、鼠伤寒沙门氏菌(CMCC 50115)、单增李斯特菌(GIM 1.229)均购自中国微生物菌种网；14株金黄色葡萄球菌由大连民族大学生命科学学院崔京春教授惠赠。

1.1.2 试剂 蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、NaCl购自北京奥博星生物技术有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)购自北京夏新生物技术有限公司；Bst DNA聚合酶、DL5000 Marker、MgCl2、甜菜碱、dNTP Mixture、6×Loading Buffer 购自大连宝生物公司；引物委托上海博亚生物技术有限公司合成。

1.1.3 仪器与设备 ABI 9700型PCR扩增仪(美国ABI公司)，DYCP-31DN型电泳仪(北京六一仪器厂)，GelDoc-It型凝胶成像仪(美国UVP公司)，SW-OJ-2FD型洁净工作台(苏州安泰安气技术有限公司)，H1850R型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，Eppendorf移液枪(德国Eppendorf公司)，海尔微波炉(青岛海尔微波制品有限公司)，MT-180B生化恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 提取模板DNA 分别挑取金黄色葡萄球菌和其他待检菌株于LB固体培养基平板上划线接种，37 ℃恒温培养过夜。按史伟峰等[12]提取DNA的方法稍作修改。挑取培养好的单菌落置于装有50 μL无菌水的PCR小管中，95 ℃反应5 min后取出，13 000 r/min 离心2 min 待用。

1.2.2 引物设计 根据NCBI数据库中agr基因序列，采用引物设计软件Primer Explorer 3.0进行设计，得到一套特异性的LAMP引物，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，引物序列见表1。

表1 LAMP 引物

1.2.3 PCR反应条件 利用B3、F3、BIP、FIP引物扩增靶基因，反应体系为 25.0 μL，包含外引物(F3和B3)各 1.6 μmol/L，内引物(FIP和BIP)各0.2 μmol/L，dNTP 0.5 mmol/L，Bst DNA polymerase 1.0 μL(8 U)，甜菜碱 0.032 mmol/L，模板 2.0 μL，MgCl22 mmol/L，ddH2O补足体积至 25.0 μL。扩增反应条件：95 ℃反应5 min，冷却，取出加入 Bst DNA聚合酶，继续反应。反应参数为 65 ℃ 扩增50 min， 80 ℃ 10 min使酶灭活。

1.2.4 扩增产物的电泳检测 将获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，取 10 μL扩增产物与2 μL 6×Loading Buffer 混匀后，加样到 1.5%琼脂糖凝胶中，110 V电泳 30 min，于凝胶成像系统中观察，记录结果。

1.2.5 特异性分析 利用外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，按照上述LAMP方法，对大肠埃希菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、14 株金黄色葡萄球菌进行检测，扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 反应条件的优化 为增加LAMP方法检测的准确性，利用单一变量的方法分别对反应温度(67～61 ℃)，反应时间(20～60 min)，MgCl2浓度(0.8～4.0 mmol/L)，dNTP浓度(0.3～1.0 mmol/L)，甜菜碱浓度(0.1～0.4 mol/L)和内、外引物浓度比等扩增条件进行优化。

2 结果与分析

2.1 LAMP反应条件的优化

为提高LAMP方法的检测效果，分别对其反应温度、反应时间、MgCl2浓度、dNTP浓度、甜菜碱浓度和引物比例等扩增条件进行了优化。

2.1.1 LAMP反应温度的优化 设置反应温度分别为67、65、63、61 ℃，扩增50 min，使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果见图1。由图1可知，当反应温度为65 ℃时扩增条带最清晰。故确定65 ℃为LAMP最适反应温度。

2.1.2 LAMP反应时间的优化 设置反应时间分别为 20、30、40、50、60 min，扩增50 min，使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测实验，结果见图2。由图2可知，反应40 min后开始出现扩增条带，但条带不清楚，反应50 min后扩增条带逐渐变亮、变清晰。故确定50 min作为LAMP最适反应时间。

图1 反应温度的优化Fig.1 The optimization of the reaction temperatureM：DNA marker 5 000 bp ；1～4：反应温度分别为67、65、63、61 ℃；5为阴性对照M：DNA marker 5 000 bp; 1：67 ℃; 2：65 ℃; 3：63 ℃; 4：61 ℃; 5：negative control

图2 反应时间的优化Fig.2 Optimization of the reaction timeM：DNA marker 5 000 bp；1～5：反应时间分别为 20、30、40、50、60 minM：DNA marker 5 000 bp; 1：20 min; 2：30 min; 3：40 min; 4：50 min; 5：60 min

2.1.3 LAMP反应体系中MgCl2浓度的优化结果 调整反应体系中MgCl2浓度分别为0.8、1.6、2.0、2.4、3.2、4.0 mmol/L，扩增50 min，使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测实验，结果见图3。由图3可知，扩增条带的亮度随MgCl2浓度增加而变亮，当MgCl2浓度达到2.4 mmol/L时最清晰，但不再随MgCl2浓度增加而改变。故确定LAMP反应体系中MgCl2最适浓度为2.4 mmol/L。

2.1.4 LAMP反应体系中dNTP浓度的优化 设dNTP浓度分别为0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L，扩增50 min，使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测实验，结果见图4。由图4可知，扩增条带的亮度随dNTP浓度增加而逐渐增大，当dNTP浓度达到0.8 mmol/L时最清晰。故确定LAMP反应体系中dNTP最适浓度为0.8 mmol/L。

图3 MgCl2浓度的优化Fig.3 The optimal concentration of MgCl2M：DNA marker 5 000 bp；1～6：MgCl2浓度分别为0.8、1.6、2.0、2.4、3.2、4.0 mmol/LM：DNA marker 5 000 bp; 1：0.8 mmol/L; 2：1.6 mmol/L; 3：2.0 mmol/L; 4：2.4 mmol/L; 5：3.2 mmol/L; 6：4.0 mmol/L

图4 dNTP 浓度的优化Fig.4 The optimal concentration of dNTPM：DNA marker 5 000 bp；1～4：dNTP浓度分别为0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L M：marker 5 000 bp; 1：0.3 mmol/L; 2：0.5 mmol/L; 3：0.8 mmol/L; 4：1.0 mmol/L

2.1.5 LAMP反应体系中甜菜碱浓度的优化 将甜菜碱浓度分别调整到0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L，扩增50 min，使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果见图5。由图5可知，扩增条带的亮度随甜菜碱浓度增加而减弱，甜菜碱浓度在 0.1 mol/L时条带最清晰。故确定LAMP反应体系中甜菜碱最适浓度为0.1 mol/L。

2.1.6 LAMP反应体系中外引物和内引物浓度比的优化 调整外、内引物浓度比分别为1∶4(即外引物各0.4 μmol/L，内引物各1.6 μmol/L)和1∶8(即外引物各0.2 μmol/L，内引物各1.6 μmol/L)，扩增50 min，使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果见图6。由图6可知，扩增条带在引物浓度比为1∶8时条带最清晰，故确定LAMP反应体系中外、内引物最适浓度比为1∶8。

图5 甜菜碱浓度的优化Fig.5 The optimal concentration of BetaineM：DNA marker 5 000 bp ；1～4：甜菜碱浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4 mol/LM：DNA marker 5 000 bp; 1：0.1 mol/L; 2：0.2 mol/L; 3：0.3 mol/L; 4：0.4 mol/L

图6 引物浓度比的优化Fig.6 The optimal concentration of primersM：DNA marker 5 000 bp； 1：引物浓度比为1∶4；2：引物浓度比为1∶8 M：DNA marker 5 000 bp; 1：the concentration ratio between inner primer and outer primer is 1∶4; 2：the concentration ratio between inner primer and outer primer is 1∶8

2.2 引物的特异性

图7 金黄色葡萄球菌的特异性检测结果Fig.7 The result of primers specificity

M：DNA marker 2 000 bp ；1～14：不同的金黄色葡萄球菌；

15：阴性对照；16：阳性对照；17～20：副溶血弧菌、大肠埃希菌、单增李斯特菌、沙门氏菌

M：DNA marker 2 000 bp; 1～14：differentS.aureusstrain; 15：negative control; 16：positive control; 17：Vibrioparahaemolyticus; 18：Escherichiacoli; 19：Listeriamonocytogenes; 20：Salmonellarange

用优化后的LAMP体系分别对18株实验菌株进行扩增，特异性检测结果如图7所示，14株金黄色葡萄球菌均得到阳性结果，其他4株非金黄色葡萄球菌表现为阴性。

3 讨 论

随着科技的发展及生活水平的提高，人们越来越关心自身的健康问题，对于食品安全的关注也更为迫切。目前，用于金黄色葡萄球菌检测的靶基因主要从特异性基因位点、抗药性基因和毒素基因三个方面入手[13]。包括耐药性相关基因mecA和femA，毒素相关基因SEA、SEB、SEC、SED、SEI和SEJ等，特异性鉴别基因nuc、clfA、scpA、sspB和SmaI酶切片段等[14]。本研究通过对不同食品中金黄色葡萄球菌特有的分子特征和生理生化特性进行比较分析，选择了agr作为检测金黄色葡萄球菌的特异靶基因。在病原菌中存在复杂的调节致病因子分泌的机制，agr和sarA是金黄色葡萄球菌中研究最多的毒力响应调节因子，其中起中心作用的是agr群体感应系统，近年来成为细菌毒素分泌调节研究及新型抗菌药物研发的热点[15]。由于agr具有较好的特异性，因此利用agr作为一个新的药物靶点来进行研究，具有良好的应用前景。

设计引物时，将agr的基因序列在GenBank上同源对比，对获得的同源序列进行分析，发现目标片段的DNA序列与数据库的SA具有100%同源性，而与其他葡萄球菌和非葡萄球菌没有同源性或同源性很低。同时，对设计出来的4种引物进行特异性检测，发现其具有良好的特异性，并且能明确地扩增靶基因，达到预期的结果。最后，评估LAMP检测方法的特异性并对其反应条件进行细致的优化，包括反应温度、反应时间、MgCl2浓度、dNTP浓度、甜菜碱浓度和长短引物浓度比等扩增条件。

本研究建立了一种新的LAMP检测方法，该方法将对金黄色葡萄球菌的临床诊断和食品安全监测发挥重要作用。

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The Establishment of a Rapid agr Gene-Targeting Detection Method for Staphylococcus aureus

LIAO Ying-ling1， GENG Ning1， JIN Xiao-lu1， QUAN Chun-shan1,2， JIN Li-ming1,2， HU Wen-zhong1,2

(1.Coll.ofLifeSci.,DalianNationalitiesUni.,Dalian116600; 2.KeyLab.ofBiotech. &Bio-Res.Util.,TheStateEthnicAffairsComm. &Minist.ofEdu.,Dalian116600)

This paper aims to establish a method of a loop-mediated isothermal amplification assay (LAMP) for the rapid detection ofStaphylococcusaureus. Firstly, a highly specific set of four primers was designed according to the accessory gene regulator ofS.aureus. Secondly, the concentration of betaine, dNTP and the ratio of long and short primer ratio, and other factors in the LAMP system were optimized. Finally, the specificity of primers was tested and evaluated against 14S.aureusstrains and 4 other pathogenic strains. The results showed that the effect of the amplification reached to an optimal effects under 65 ℃ react for 50 min, concentration of Mg2+at 2.4 mmol/L, concentration of dNTP at 0.8 mmol/L, and betaine at 0.1 mol/L, and the ratio of long and short primer at 1∶8. After the optimization the LAMP assay forS.aureuswas positive, while negative for non-S.aureusstrains, thus proved that the primers had the specificity. A simple, rapid and strong specific assay for detectingS.aureushas been established usingagrgene as the target gene for the first time. It possessed significance in food security detection.

Staphylococcusaureus;agr; loop-mediated isothermal amplification; rapid detection

科技部十二五国家科技支撑计划(2012BAD38B05)；中央高校基本科研基金(DC12010118)

廖颖玲 女，本科。研究方向为生物工程。Tel:0411-87656219, E-mail:yingling2014@139.com

* 通讯作者。女，教授，博士。研究方向为生物工程、微生物学。Tel:0411-87656219,E-mail:mikyeken@dlnu.edu.cn

2014-10-12；

2014-11-18

Q789; R378.2+1

A

1005-7021(2015)04-0019-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.004