苏晨，赵爱华，张瑶楠，丁宁，郭永＊，王乾兴

（1.遵义医学院细胞生物学与遗传学教研室，遵义 563000；2.国家卫生计生委男性生殖健康重点实验室，国家卫生计生委科学技术研究所，北京 100081；3.解放军第309医院妇产科，北京 100091）

全球乳腺癌发病率自20 世纪70 年代末开始一直呈上升趋势，作为严重威胁女性生命安全的主要疾病之一，乳腺癌的病因尚未完全清楚，医生会根据肿瘤的分期和患者的身体状况，酌情采用手术、放疗、化疗、内分泌治疗、生物靶向治疗及中医药辅助治疗等多种手段，其中约2／3 的治疗是激素治疗［1］。米非司酮作为一种强抗孕激素类物，同时，米非司酮还具有增强抗癌药物疗效、抑制肿瘤细胞增殖等其它一些新的功能，可用于乳腺癌的内分泌治疗［2］。米非司酮在孕激素受体阴性的乳腺癌中表现出抗癌作用，但其作用机制尚未明确，可见米非司酮的作用机制尤为复杂，米非司酮可以在不同条件下通过不同的作用机制来发挥抗肿瘤作用。BRCA 肿瘤抑制基因（BRCA tumor suppressor）是乳腺癌／卵巢癌特异性的肿瘤抑制基因［3］。本研究旨在通过研究不同浓度米非司酮对乳腺癌细胞处理后中BRCA1、BRCA2蛋白的表达变化，进一步明确米非司酮的作用机制，为米非司酮乳腺癌内分泌治疗中相应治疗机制的阐明提供科学的实验依据。

材料与方法

一、材料与试剂

1.细胞系：乳腺癌细胞系MCF7购自于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培养基，37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。

2.主要试剂：米非司酮（Sigma，美国），DMEM培养基、RPMI 1640培养基、FBS、0.25%胰蛋白酶（GIBCO，美 国），小 鼠 抗 人BRCA1 单 克 隆 抗 体（Calbiochem，德国），兔抗人BRCA2 多克隆抗体（Santa，美国），两步法抗小鼠二抗检测试剂盒、两步法抗兔二抗检测试剂盒、DAB 显色试剂盒（北京中杉金桥）。

二、实验方法

1.细胞处理方法及实验分组：根据本实验室前期研究［4］，分别用浓度为0.25、2.5、25和50μmol／L米非司酮处理人乳腺癌细胞系MCF-7 细胞，处理1d后分别收集不同处理组细胞。根据米非司酮的浓度分为：对照组（以空白溶剂代替米非司酮）、0.25μmol／L组、2.5μmol／L 组、25μmol／L 组 和50μmol／L组。

2.细胞爬片制备：将0.8cm×0.8cm 干净玻璃片置于培养瓶底部，待细胞贴壁生长于玻璃片后，取出玻璃片浸泡于丙酮︰甲醇（1︰1）固定液中，4℃固定15min，取出玻璃片，自然晾干，用中性树胶贴附于载玻片上，进行免疫组化实验。

3.细胞免疫组织化学法：将细胞爬片置PBS缓冲液中浸洗5min后，置于1% Triton X-100，室温处理15min；PBS浸洗3次，5min／次，3% H2O2室温孵育15 min；PBS 浸洗，分别滴加BRCA1 和BRCA2一抗稀释液（抗BRCA1稀释为1∶100，抗BRCA2为1∶150），4℃过夜。PBS浸洗，滴加两步法二抗工作液，37℃孵育30min；PBS浸洗，DAB显色剂显色，显微镜下控制显色情况；自来水充分冲洗，苏木素复染15min；梯度酒精脱水透明，中性树胶封片。PBS代替一抗为阴性对照。

4.平均光密度值半定量分析：在显微镜下，分别随机选取各组5 个视野拍照，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics，美国）对各组照片进行平均光密度值半定量分析，样本数值为5个视野光密度值的平均值。

5.BRCA1、BRCA2蛋白细胞核内阳性表达率计算：由两人分别对各组的5个视野进行全细胞计数以及细胞核表达阳性细胞计数，细胞核内表达率＝细胞核阳性细胞数／细胞总数，各组数值为各视野细胞核内表达率平均值。

三、统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行数据的处理和统计分析，计量资料采用（±s）表示，均数间多重比较采用Fisher LSD 检验，多组间比较采用One-way ANONA，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、比较不同浓度米非司酮处理的MCF7细胞中BRCA1蛋白表达

免疫组织化学结果显示：对照组和米非司酮处理各组均呈BRCA1蛋白阳性表达（图1）。与米非司酮处理各组相比较，对照组细胞中BRCA1蛋白表达较弱，且呈细胞胞浆阳性（图1A）；米非司酮0.25μmol／L组细胞BRCA1蛋白主要表达于胞浆，少量细胞呈核阳性（图1B）；米非司酮2.5μmol／L组细胞BRCA1蛋白阳性强于其他各组，其细胞核和细胞浆均为阳性（图1C）；阴性对照组未有阳性表达（图1F）。

采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics）进行各组图像平均光密度值分析，结果显示：与其他各组相比较，2.5μmol／L 组BRCA1蛋白表达量最高，显著高于其他各组（P 均＜0.05）；25μmol／L 组BRCA1 蛋 白 表 达 量 高 于 对 照 组、0.25μmol／L组和50μmol／L 组，差异有统计学意义（P 均＜0.05）；对 照 组、0.25 μmol／L 组 和50μmol／L组各组之间差异无统计学意义（P ＞0.05）（图2）。

二、比较不同米非司酮处理的MCF7 细胞中BRCA2蛋白表达

结果显示：BRCA2蛋白在对照组和米非司酮处理各组均有表达（图3）。对照组细胞中，BRCA2蛋白主要表达于细胞胞浆中（图3A）；米非司酮各组BRCA2蛋白阳性较强，细胞胞浆和细胞核中均有表达（图3B、C、D 和E）阴性对照组未有阳性表达（图3F）。

各组图像平均光密度值比较发现：米非司酮处理各组平均光密度值均高于对照组，差异具有统计学意义（P 均＜0.05）；2.5μmol／L 组平均光密度值最高，显著高于0.25μmol／L 组、25μmol／L 组和50μmol／L组（P＜0.05）（图4）。

三、不同浓度米非司酮组细胞核BRCA1、BRCA2蛋白阳性表达率

对照组细胞核中BRCA1和BRCA2 蛋白阳性表 达 率［（分 别 为（19.58±6.90）% 和（36.60±3.01）%）］均较低，显著低于米非司酮其他各组（P 均＜0.05）；2.5μmol／L组和25μmol／L组细胞核中BRCA1蛋白阳性表达率显著高于0.25μmol／L组和50μmol／L 组，差 异 有 统 计 学 意 义（P 均＜0.05）；米非司酮处理各组细胞核BRCA2蛋白阳性率之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

讨 论

乳腺癌易感基因1（BRCA1）和乳腺癌易感基因2（BRCA2）是乳腺癌发生有关的两个易感基因，乳腺癌的发生、发展和转移与这两种基因的异常表达密切相关。BRCA1 是1990 年首次发现并定位于17号染色体的长臂的多功能区核蛋白，基因结构全长约81KB，包含24个外显 子，其中22个编码［5］；BRCA2是1994 年由Wooster等［6］定位于13q12-13，基因结构全长约60kb，由10 254 个核苷酸组成，含21 个外显子。抑癌基因BRCA 表达的蛋白具有重要的生物学功能，包括细胞周期调控、DNA损伤修复、基因的转录调节、细胞凋亡和泛素化等，尤以两者在DNA 损伤修复、同源重组和转录调控中的功能最为显著和重要。

图1 不同浓度米非司酮对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞的BRCA1蛋白的表达影响。免疫组化法×200

图2 不同浓度米非司酮对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞的BRCA1蛋白表达定量分析结果

目前临床上已经将米非司酮广泛用于抗肿瘤的治疗，也已经进入临床试验阶段。目前关于米非司酮抗肿瘤作用的可能机制主要有：促进肿瘤细胞凋亡［7］、抑制肿瘤细 胞的增殖［8］、调节细胞 周期［9］、调节细胞因子或受体［10］、逆转肿瘤细胞耐药性［11］等。1987年，Bardon等［12］发现米非司酮具有抗乳腺癌细胞增殖作用。业已证实，米非司酮对人类乳腺癌细胞有剂量依赖性的生长抑制作用，而且这种作用与细胞中孕酮受体呈明显正相关，作用机制可能与其各自的孕酮受体容量有关。另外还发现，对于绝经前妇女，米非司酮（连续3个月隔天给予50mg剂量）能够抑制乳腺癌细胞的增殖，对于乳腺上皮细胞具有一定的保护作用［13］。

3 不同浓度米非司酮对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞的BRCA2蛋白表达影响。免疫组化法×200

图4 不同浓度米非司酮对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞的BRCA2蛋白表达定量分析结果

表1 不同浓度米非司酮组细胞核BRCA1、BRCA2蛋白阳性率比较［（±s）%］

表1 不同浓度米非司酮组细胞核BRCA1、BRCA2蛋白阳性率比较［（±s）%］

注：与米非司酮各组比较，＊P 均＜0.05；分别与50 μmol／L组比较，＃P＜0.05

组 别 BRCA1蛋白阳性率 BRCA2蛋白阳性率对照组 19.58±6.90＊ 36.60±3.01＊0.25μmol／L 50.32±8.83 93.65±2.45 2.5μmol／L 95.92±0.27＃ 95.79±0.86 25μmol／L 93.26±3.37＃ 97.40±0.97 50μmol／L 63.49±34.14 85.69±23.61

我们前期结果显示，米非司酮抑制乳腺癌细胞系MCF-7和T47D 细胞增殖、促进细胞凋亡。2006年，Poole等［14］在Science杂志上发表了他们研究小组的重要结果：BRCA1／p53 基因敲除小鼠中米非司酮可以抑制乳腺癌的生长。有研究表明，在乳腺癌细胞中，BRCA1基因的表达受激素的调控（雌激素和孕激素）［15］，而米非司酮作为孕激素受体的拮抗剂极有可能通过调控BRCA1或BRCA2在乳腺癌中发挥作用。我们前期研究证实，米非司酮确实在转录水平上调控BRCA1 和BRCA2 基因的表达［16］。而本研究发现，米非司酮也在蛋白水平上上调乳腺癌细胞系MCF7细胞中BRCA1、BRCA2的表达。与对照组比较，不同浓度米非司酮处理后，MCF7细胞中BRCA1 和BRCA2蛋白的表达量均增加，2.5μmol／L 组BRCA1和BRCA2蛋白表达量最高，但随着米非司酮浓度增加，BRCA1 和BRCA2蛋白的表达量有所降低，可能是不同浓度米非司酮促蛋白表达模式不同。

BRCA1和BRCA2 肿瘤抑制基因的主要功能是参与细胞分裂S 期和细胞DNA 损伤后的DNA修复，BRCA 突变细胞缺乏染色体双链DNA 缺口的修复能力，导致染色体不稳定。在突变携带人群中，由于不能有效地进行DNA 双链缺口修复，从而导致早期乳腺癌和卵巢癌的发生［17］。本研究显示，米非司酮处理后，BRCA1和BRCA2蛋白表达有空间定位变化，对照组细胞中BRCA1蛋白呈细胞胞浆阳性；米非司酮0.25μmol／L 组则主要表达于胞浆，少量细胞呈核阳性；米非司酮2.5μmol／L 组细胞核和细胞浆均为阳性。对照组细胞中，BRCA2蛋白主要表达于细胞胞浆中；米非司酮各组细胞胞浆和细胞核中均有表达。通过比较各组的细胞核内阳性表达率发现，对照组细胞核中BRCA1和BRCA2蛋白阳性表达率分别为（19.58±6.90）%和（36.60±3.01）%，均呈较低状态，且显著低于米非司酮各个组（P 均＜0.05）；米非司酮2.5μmol／L组和25μmol／L组细胞核中BRCA1 蛋白阳性表达率显著高于0.25μmol／L组和50μmol／L组，差异有统计学意义（P 均＜0.05）。即米非司酮可以促进MCF7细胞中BRCA1、BRCA2蛋白的入核表达，有利于BRCA1和BRCA2基因发挥DNA修复、同源重组和转录调控等功能，但米非司酮调控的具体作用机制及其生物学功能还需要进一步深入展开研究。

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