屠宰场疑似牛结核病料的细菌分离和PCR鉴定

古努尔·吐尔逊1，努尔巴哈提1，古丽拜克热木·斯拉吾丁2，郭慧玲1，呼西旦·阿巴拜克力1*
（1.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐830000；
2.新疆察布查尔县兽医站，新疆 察布查尔835300）

为了解屠宰场疑似牛结核组织病料中结核分枝杆菌复合群（MTC）的感染状况，在乌鲁木齐市屠宰场采集包括肺、淋巴结、乳房在内的16份疑似牛结核可疑结节,分别接种于培养基进行结核分枝杆菌复合群（MTC）的分离，获得的5株临床分离菌用MTC多重PCR鉴定，两株为MTC菌株，两株为非结核分枝杆菌，另一株未扩增出可用于鉴定的特异性片段。该结果表明屠宰场所采病料中存在结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的感染。

牛结核；MTC；多重PCR

修回日期：2015-02-11

牛结核是由结核分枝杆菌复合群（MTC）中的牛结核分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人畜共患病[1]。MTC包括结核杆菌、牛分支杆菌、非洲分枝杆菌、微小分枝杆菌、卡氏分枝杆菌和卡介苗，这些菌株都可感染牛并出现结核结节样病变。该病主要通过患病呼吸道分泌物和咳嗽所产生的气溶胶感染；人则主要通过食用未经高温处理病牛的奶肉感染[2,3]。屠宰场的检疫是防治感染牛肉进入市场的最后环节[4]。在屠宰场，检疫人员主要是通过肉眼观察屠宰后牛的相关组织及其淋巴结的变化，初步确定是否有MTC感染[5,6]，但最后的确诊还需要进行MTC的分离和鉴定。该项工作不仅耗时长，技术操作繁琐，而且常出现非特异性反应。

近年来，随着分子生物学技术的发展以及结核杆菌特异性核苷酸序列分析所取得的成果，通过基因扩增进行MTC鉴定已成为该类菌鉴定最可靠的技术方法之一[7,8]。建立的利用该方法能快速、特异性的鉴别出结核病牛组织中MTC的种属并对其作出准确诊断。本实验用Steve Wilton等建立的16s rRNA多重PCR方法[7]，对屠宰场采集的可疑结节病料中分离到的菌株进行了鉴定，简便、快速确定了MTC的感染。

1 材料与方法

1.1试剂

2×Taq PCR Master Mix购自全式金生物技术公司；100bp DNA Marker、EB(溴化乙锭)购自鼎国公司昌盛生物技术有限责任。其它试剂均为国产。

1.2 培养基

用于MTC分离的丙酮酸钠培养基和甘油培养基（Lowenstein-Jensen）均由本实验室按标准配方制备。

1.3 引物设计

参照Steve Wilton[7]等文献设计引物，由鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。

1.4 病料来源

采自乌鲁木齐市屠宰场宰后检疫采集的疑似结核病变组织，该组织包括肺、淋巴结、乳房等。屠宰牛分别来自乌鲁木齐米东区、昌吉、伊犁。

1.5 参考菌种

牛分枝杆菌标准株M.bovis菌由北京解放军309医院提供，本实验室保存。

1.6疑似结核病料的采集

在屠宰场与当地检疫人员合作，共对屠宰后的800余头牛进行了肺、淋巴结、胸膜、支气管、乳房等脏器的感官和触摸检查，采集有结节状病变且坚硬、无滑动感的病变结节。见图1、图2。

图1 乳房组织中的疑似结核结节

图2 肺组织中的疑似结核结节

1.7病料中MTC的分离培养

分别从16份病变组织样品结节内吸出黄色痰性物，匀浆后加入4%的等量NaOH；室温静置20 min后，用2mol/L HCl调PH至7.2~7.4，4 000 rpm离心20 min，沉淀悬浮于生理盐水，用移液器取0.2 mL接种至丙酮酸钠培养基和甘油培养基（Lowenstein-Jensen），37℃培养4～8周，观察结果。

1.8待检菌株的处理

分别将分离菌株、牛分枝杆菌参考株加入含有TE缓冲液（pH8.0）试管中，置水浴锅中煮沸10 min灭活并释放DNA，4 000 rpm离心20 min，收集上清，用于PCR扩增。

1.9多重PCR扩增

分别以牛分枝杆菌参考株作为阳性对照，H2O作为空白对照，对处理后的样品进行多重PCR扩增。PCR引物分别为Mycgen、TB1、Mycav和Mycint共4对；反应体系为10 μL：其中样品3 μL，4对引物的上下游引物各0.2 μL。反应条件为94℃10 min，61℃2min，72℃3 min；1个循环后再以94℃1 min，61℃2 min，72℃3 min扩增33个循环；再以94℃10 min，61℃2 min，72℃3 min扩增1个循环。扩增产物置4℃保存。取PCR产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳，分析结果。

1.10扩增产物结果判定

引物MYCGEN扩增出1030 bp片段为分枝杆菌，引物TB扩增出372 bp片段为MTC（包括人分枝杆菌和牛分枝杆菌等）；MYCA引物扩增出180bp片段为禽分枝杆菌，MYCINT引物扩增出850 bp片断为胞内分枝杆菌。

2 结果与分析

2.1病料采集与细菌分离

共检疫出16份疑似结核病变的结节组织，切开结节可见有黄色痰性物。从16份病料中分离到疑似MTC 5株，其编号为SM1，SM2，SM3，SM4和SM5。

2.2多重PCR鉴定结果

从图3的扩增产物电泳图可见，第2、5泳道的临床菌株SM2和SM5分别被引物MYCGEN扩增出了1030 bp片段和被引物TB扩增出了372 bp片段，两对引物扩增出的DNA带型与第6泳道的参考菌株一致，即确定为MTC群；第1、3泳道的临床菌株SM1和SM3仅被引物MYCGEN扩增出1030 bp片段，表明为分枝杆菌；第4泳道的株菌SM4所有引物均未扩增出DNA片段，表明该菌株为非MTC。

3 讨论

牛结核是由MTC中牛结核分枝杆菌引起的一种人兽共患慢性传染病，以渐进性消瘦、咳嗽、多种组织器官形成干酪样坏死或钙化结节为特征。我国农业部将其列为二类动物疫病。该病依据流行病学、临床症状、病理变化可做出初步诊断。确诊则需进一步做病原分离鉴定或免疫学诊断。屠宰场的检疫则是防止该病及其畜产品扩散、蔓延最后的关口[9]。我们为了解我区屠宰牛疑似结核结节中MTC的感染现状，根据其特征性病理变化采集了相关的病料并进行了病原学检测，确诊了我区部分地区屠宰牛有结核菌感染的情况。

MTC是分枝杆菌5个复合群之一，也是3大致病性复合分枝杆菌群（鸟胞内和偶然分枝杆菌）成员之一[10]。PCR菌种鉴定法是用结核分枝杆菌复合群的特异性引物对待检菌株DNA进行PCR扩增，根据扩增产物所产生的特异性片段进行鉴定。本实验对疑似结核结节中分离菌株选择分枝杆菌16S rRNA基因进行扩增发现，所采病料中除MTC菌株外，还有非MTC感染存在，同时也证明该方法可以区分病料中MTC和非MTC感染。

[1]Ameni G，Aseffa A，Sirak A，et al．Effect of skin testing and segregation on the prevalence of bovine tuberculosis and molecular typing of Mycobacterium bovis in Ethiopia[J]．The Veterinary Record，2007，161(4)：782－786．

[2]Ameni G，Amenu K，Tibbo M．Bovine tuberculosis：prevalence and risk fact or assessment in cattle and cattle owners in Wuchale—Jida District，Central Ethiopia[J]．Int J Appl Ras，2003．

[3]兰德松．牛结核病及其风险分析[J]．中国人兽共患病学报,2011，27(9)：839-841．

[4]木旦古丽·艾山,吐送古丽·吐送尼牙孜.牛结核病在屠宰中的检疫和处理[J]．中国动物检疫，2007，24 （10）：31．

[5]古丽帕夏·吐尔逊.牛结核病的屠宰鉴定和处理[J]．新疆畜牧业，2013，（2）：5-51.

[6]努尔古丽·艾买提，艾力麦麦提·麦麦提力.牛结核病的屠宰鉴定和处理[J]．新疆畜牧业，2007，（5）:33-35．

[7]Steve Wilton1, and Debby Cousins. Detection and Identification of Multiple Mycobacterial Pathogens by DNA Amplification in a Single Tube[J]．PCR Methods and Applications,1992，1(4)：1637-1650．

[8]Q.Nahar, M.Pervin, T.Islam, et al. Application of PCR for the detection of bovine tuberculosis in cattle[J]. J. Bangladesh Agril. Univ., 2011, 9(1):73-78.

[9]王华，孙成友，王淑娟，等．牛结核病的传播特点和风险因素及防控[J]．现代生物医学进展，2013，13 （23）：4583-4586.

[10]王忠仁．牛结核病与人结核病的相互关系[J]．中国防涝杂志，2005，27（2）：123-125．

MTC；multiplex PCR

Mycobacterium Tuberculosis Isolation from Suspected Samples Collected in Slaughterhouse and the Identification by PCR

GULNUR·Tursun1，NURBAHTI1，GULBAHREM·Sirayiding2，GUO Hui-ling1，HUXIDAN·Ababekiri1
（1. Institute of Veterinary Medicine, Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi 830000，China；
2. Veterinary Station of Qapuqal County，Qapuqal Xinjiang 835300，China）

To understand of the infection status on of mycobacterium tuberculosis complex（MTC）from suspected tissue of bovine tuberculosis in abattoir,16 suspected tissue samples including lung, lymph nodes, breast, were collected and the MTC were isolated. 5 strains obtained from the culture were identified by MTC multiple PCR. Result shows that 2 of them are MTC and other 2 non-MTC, another one has no specific sizes for identification. It also shows that MTC and non-MTC were existed in suspected samples collected in slaughterhouse.

bovine tuberculosis；

S851

A

1003－6377（2015）03－0039-04

新疆维吾尔自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目“草食家畜促生长、致病微生物和抗病基因的查验证及检测方法的建立”（KY2014008）

古努尔·吐尔逊（1971-），女，高级实验师，主要从事牛结核病的预防研究。

E-mail :gulnural@126.com

呼西旦·阿巴拜克力，女，研究员，主要从事牛结核病的预防研究。

E-mail:1981014258@qq.com

2015-02-05，