叶继辉 李超芬 丁群力

亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌医院感染危险因素分析

叶继辉 李超芬 丁群力

目的 了解亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）医院感染的危险因素，并探讨Ⅰ类整合子在鲍曼不动杆菌亚胺培南耐药中的作用。方法选取确诊为CRAB医院感染患者54例作为病例组，按1:3配对选择162例亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌（CSAB）医院感染患者作为对照组，采用单因素分析及多因素logistic回归分析其危险因素，PCR检测Ⅰ类整合酶基因。结果单因素分析发现，与CRAB医院感染相关的危险因素有病情危重、入住ICU时间、住院时间≥14d、机械通气/人工气道、留置尿管、中心静脉置管、免疫抑制剂的使用、抗生素使用时间≥7d、抗生素药物种类≥3种。多因素logistic回归分析发现，病情危重（OR:8．47; 95%CI:1．56～46．0）、入住ICU时间（OR:9．32;95%CI:1．83～47．43）、住院天数≥14d（OR:13．89;95%CI:3．07～62．85）、机械通气/人工气道（OR:18．86;95%CI:4．38～81．31）、抗生素使用种类≥3种（OR:6．16;95%CI:1．85～20．51）、抗生素使用时间≥7d（OR: 5．41;95%CI:1．36～21．58）是CRAB医院感染的独立危险因素；CRAB组中Ⅰ类整合酶基因检出率（59．3%）显著高于CSAB组（34．6%），差异有统计学意义（P＜0．001）。结论病情危重、入住ICU时间、住院时间、机械通气/人工气道、抗生素使用种类≥3种、抗生素使用时间≥7d是CRAB医院感染的独立危险因素，Ⅰ类整合子在CRAB中普遍存在，需加强对相关危险因素的控制及耐药机制的研究，早期防治CRAB医院感染的发生。

亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌 医院感染 危险因素 Ⅰ类整合子

近年来不动杆菌已成为医院感染的常见病原菌，其 临床分离率逐年上升[1]，而且该菌多药耐药现象日趋严重[2-3]，自1991年美国首次分离出碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌[4]（CRAB）后，陆续在世界各地被分离出，并出现泛耐药鲍曼不动杆菌、全耐药鲍曼不动杆菌，为临床治疗带来极大难度，因而早期发现其危险因素、研究其耐药及传播机制显得尤为重要。为掌握本地区亚胺培南耐药鲍曼不动菌（carbapenem resistant acinetobacter baumannii，CRAB）医院感染的相关危险因素，笔者对本地区3家医院CRAB医院感染患者进行1∶3配对病例对照研究，寻找CRAB医院感染的危险因素；同时采用PCR技术，检测本地区鲍曼不动杆菌I类整合子的分布情况，探讨其对鲍曼不动杆菌亚胺培南耐药性的影响，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2012年1至12月宁波市第一医院24例、宁波大学医学院附属医院20例和宁波市第九医院10例均经确诊为CRAB医院感染患者，男30例，女24例，年龄48～76岁，平均（54.7±9.8）岁。按1∶3配对选择与病例组同期住院的亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌（carbapenem susceptible acinetobacter baumannii，CSAB）医院感染患者162例（宁波市第一医院74例、宁波大学医学院附属医院57例、宁波市第九医院31例），男89例，女73例，年龄43～79岁，平均（56.1± 13.2）岁。两组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 药物敏感试验 所有菌株均由VITEK 2全自动微生物鉴定系统鉴定，质控菌株为大肠埃希菌株ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853，均购自卫生部临床检验中心。M-H培养基、亚胺培南纸片10μg、美罗培南纸片10μg购自英国Oxoid公司。药物敏感性根据美国临床实验室标准化研究所（CLIS2009）[5]的标准进行抗生素药物判读，MIC值≥2μg/ml被认为碳青酶烯类耐药株，然后经E-test实验确认。

1.2.2 资料收集方法 调查内容包括：（1）一般情况：姓名、性别、年龄、诊断、基础疾病、病情、血清白蛋白浓度、住院时间、入住ICU时间；（2）介入性操作：手术、麻醉、引流、气管插管、机械通气、导尿管、动静脉置管以及其他介入操作等；（3）药物治疗情况：抗生素使用种类及时间、免疫抑制药的应用。

1.2.3 细菌DNA制备 采用细菌DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒操作说明提取细菌DNA，试剂盒为广州合达天根公司产品（试剂编号：DV810A）。

1.2.4 Ⅰ类整合子检测 Ⅰ类整合子检测PCR引物参考文献[6]，由上海英骏公司合成，上游引物序列为5′-CAGTGGACATAAGCCTGTTC-3′，下游引物序列为5′-CCCGAGGCATAGACTGTA-3′，预期扩增片段为160bp。扩增体系：扩增体系50μl，包括正反引物各1μl，模板1μl，缓冲液（×10）10μl，镁离子（1.5mmol/L）3μl，Taq酶（5U）0.25μl，dNTP（2.5mmol/L）1μl，双蒸水补足至50μl。反应条件：95℃10min扩增前预变性；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；扩增后延伸：72℃10min。扩增产物以1.2%琼脂糖凝胶（加EB）电泳，电泳电压为100V，电泳30min。电泳完毕后，放入凝胶成像系统机内，观察结果。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验，计数资料组间比较采用χ2检验，相关变量进行单因素分析；将单因素分析具有统计学意义及具有专业意义的因素进行多因素条件logistic回归分析，判断独立危险因素。各因素赋值如表1。

表1 CRAB医院感染影响因素赋值表

2 结果

2.1 感染部位及Ⅰ类整合子检测电泳结果 所有患者均经临床送检标本证实，主要感染部位是呼吸道感染159例（73.6%），血流感染25例（11.6%），烧伤和创伤分泌物23例（10.6%），尿路感染5例（2.3%），其它4例（1.9%），所有标本经Ⅰ类整合子检测电泳，电泳图见图1。2.2 CRAB医院感染的单因素分析 病情危重、入住ICU时间、住院时间≥14d、机械通气/人工气道、留置尿管、中心静脉置管、免疫抑制剂的使用、抗生素使用时间≥7d、抗生素使用种类≥3种是CRAB医院感染的主要危险因素，详见表2。

2.3 多因素条件logistic分析 将单因素分析中差异有统计学意义的9个变量再进行logistic多因素回归分析，结果显示病情危重、入住ICU时间、住院天数≥14d、机械通气/人工气道、抗生素使用种类≥3种、抗生素使用时间≥7d是CRAB医院感染的独立危险因素，详见表3。2.4 Ⅰ类整合子检出率比较 在检测的54株CRAB中发现32株整合子阳性，阳性率为59.3%，CSAB整合子阳性56株（34.6%），两组间整合子检出率差异有统计学意义（P＜0.001），详见表4。

图1 鲍曼不动杆菌I类整合子PCR产物检测（1：MARK；2：阳性对照；3：阴性对照；4～8：整合子阳性）

表2 CRAB医院感染的单因素分析

表3 CRAB医院感染的logistic多因素分析

表4 CRAB医院感染的logistic多因素分析

3 讨论

鲍曼不动杆菌是条件致病菌，在自然界分布广泛，正常人体口腔黏膜、呼吸道、消化道、泌尿生殖道及医院环境中均可检测到鲍曼不动杆菌的存在，在机体抵抗力下降、免疫力缺损及抗生素的选择压力下，鲍曼不动杆菌极易优势生长，成为致病菌。随着人口老龄化、广谱抗生素的广泛使用，鲍曼不动杆菌耐药性逐年增加，近年来CRAB在院内感染的分离率也越来越高，并可引起局部大流行[7-8]，使患者的病情更为复杂难治，住院费用大大增加，病死率高。因此，对CRAB医院感染危险因素、耐药机制的探讨，对早期防治具有重要的临床意义。

本研究显示，鲍曼不动杆菌医院感染的部位以呼吸道感染（73.6%）最多见，其次为血流感染（11.6%），与文献报道相似[9]。本研究发现，宁波地区3家医院CRAB医院感染危险因素主要包括病情危重、人工气道、雾化吸入、机械通气、免疫抑制剂的使用、抗生素使用种类和天数、是否曾经入住ICU以及侵入性操作，与国内外多项类似研究结论基本相同[10-12]。而通过logistic多因素分析发现，病情危重（OR：8.47，95%CI：1.56～46.0）、入住ICU时间（OR：9.32，95%CI：1.83～47.43）、住院时间≥14d（OR：13.89，95%CI：3.07～62.85）、机械通气/人工气道（OR：18.86，95%CI：4.38～81.31）、抗生素使用种类≥3种（OR：6.16，95%CI：1.85～20.51）、抗生素使用时间≥7d（OR：5.41，95%CI：1.36～21.58）是CRAB医院感染的独立危险因素。

鲍曼不动杆菌易于在自身免疫力减退患者体表及医疗设备上定植生长，而基础疾病多，危重病患者以及长期大量使用免疫抑制剂、糖皮质激素均会致机体免疫力低下，增加了CRAB感染的风险。CRAB医院感染与长期、大量使用多种强效广谱抗生素有关。大剂量长时间使用多种广谱抗生素抑制了正常菌群生长，导致机体菌群失调，鲍曼不动杆菌等条件致病菌在抗生素的选择压力下出现耐药，耐药菌株优势生长，最终导致患者出现难以控制的严重感染。因此，抗生素的不合理使用可导致CRAB医院感染风险显著增加，国外有研究显示抗生素的不适当使用是CRAB感染的独立危险因素[13-14]。本研究发现，人工气道/机械通气是导致CRAB院内感染风险最高的独立危险因素（OR=18.86），主要因为人工气道及机械通气导致气道黏膜受损，破坏了气道的正常防御功能，寄居于口咽部或外源性的CRAB可以直接进入下呼吸道而引起感感染，且入住ICU的患者多病情危重，而ICU环境中CRAB或泛耐药鲍曼不动杆菌甚至全耐药鲍曼不动菌均较普通病房发生率显著升高[15]，使环境中CRAB或其它高耐药细菌进入下呼吸道繁殖生长的风险显著升高。有资料显示雾化吸入也为CRAB院内感染的独立危险因素[16]，但本研究并未发现类似结果，可能因为本地区医院雾化装置均已专人专用，而不是在不同患者之间交替使用，减少了耐药菌在不同患者之间相互传播的风险性。

本研究也检测了入选菌株中Ⅰ类整合子的分布情况，以探讨整合子在鲍曼不动杆菌亚胺培南耐药中的作用。整合子系统是一种天然的克隆和表达系统，能高效率促进细菌间抗生素耐药基因的扩散，目前将已发现的整合子分为6类，其中Ⅰ类整合子最为常见，目前已在不动杆菌中发现整合子结构，并推测可能是导致不动杆菌多重耐药的重要机制。

本研究对所入选菌株均进行了Ⅰ类整合酶的测定，以对比CRAB组和CSAB组Ⅰ类整合子携带率是否存在差别。结果发现，54株CRAB组鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合酶基因扩增阳性，阳性率为59.3%，对照组阳性率34.6%，CRAB组Ⅰ类整合子阳性率明显高于CSAB组，差异有统计学意义（P＜0.001）；这也意味着CRAB组菌株存在着更加广泛的耐药谱，这与β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类药物耐药基因是整合子中最常见的插入基因盒有关，也说明了整合子对细菌多重耐药起着重要作用。本地区鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子检出率较国内其它地区增高，上海应春妹等[17]检测多重耐药鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子携带率63%，顾兵等[18]检测南京地区鲍曼不动杆菌整合子检出率为52.8%，PCR-RFLP结果显示均为I类整合子，原因可能与研究的时期、碳青酶烯类药物应用的普及率差异等因素有关[19]。

本研究分析了宁波地区3家医院CRAB院内感染的危险因素，并对CRAB中Ⅰ类整合子做了初步的研究。结果表明，病情危重、入住ICU时间、住院时间、机械通气/人工气道、抗生素使用种类≥3种、抗生素使用时间≥7d是CRAB医院感染的独立危险因素。CRAB中Ⅰ类整合子检出率明显升高，意味着CRAB常同时携带有编码对氨基糖甙类、氯霉素、甲氧苄氨嘧啶耐药的其它耐药基因，易产生多重耐药菌、泛耐药细菌甚至全耐药菌，目前国际上还未出现治疗该类细菌的有效药物，因此加强对危险因素的控制，提高CRAB的早期检测技术并深入研究临床菌株中CRAB耐药的产生和传播机制具有重要意义。

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ObjectiveTo investigate the risk factors for nosocomial infections caused by carbapenem-resistant Acinetobacter Baumanii(CRAB)．MethodsFifty-four patients with nosocomial infection by CRAB(cases)and 162 matched patients with nosocomial infection by carbapenem-susceptible Acinetobacter Baumanii(CSAB)as controls admitted in hospital from January 2012 to December 2012 were included in the study．Univariate analysis and multivariate logistic regression were used to analyze the risk factors for nosocomial infection by CSAB．ClassⅠintegron was detected by PCR．ResultsUnivariate analysis revealed that the risk factors for nosocomial infection by CRAB were pathogenetic condition,ICU stay,hospitalization≥14d,mechanical ventilation/artificial airway,urinary catheter,central venous catheter,administration of immunosuppressive agents,treatment with≥3 kinds of antibiotics and≥7d．Multivariate logistic regression analysis identified six independent risk factors:pathogenetic condition(OR 8．47;95%CI 1．56～46．0),ICU stay(OR 9．32;95%CI 1．83～47．43),hospitalization≥14d(OR 13．89;95%CI 3．07～62．85),mechanical ventilation/artificial airway(OR 18．86;95%CI4．38～81．31),treatment with≥3 kinds of antibiotics(OR 6．16;95%CI 1．85～20．51)and≥7d (OR 5．41;95%CI 1．36～21．58)．Detection rate of classⅠintegron among CRAB was significantly higher than that in CSAB(59．3% vs 34．6%,P＜0．001)．ConclusionPathogenetic condition,ICU stay,hospitalization≥14d,mechanical ventilation/artificial airway, treatment with more than 3 kinds of antibiotics,using antibiotics≥7d are likely to be risk factors for nosocomial infection by CRAB, and ClassⅠintegronare common in the CRAB．

Carbapenem-resistant acinetobacter baumaniiNosocomial infection Risk factors ClassⅠintegron

2014-08-27）

（本文编辑：严玮雯）

315000 宁波市第一医院重症医学科（叶继辉）；宁波市第九医院微生物实验室（李超芬）；宁波大学附属医院呼吸内科（丁群力）

叶继辉，E-mail：yjh-icu@qq.com