刘开泰 陆妙珍 褚宇东

TFF1在肺癌中的表达及作用研究

刘开泰 陆妙珍 褚宇东

目的 研究三叶因子1（TFF1）在肺癌组织及肺癌细胞株中的表达、甲基化状态及其功能。方法选取98例非小细胞肺癌患者手术切除的肺癌组织，采用RT-PCR、MSP检测TFF1在肺癌组织中的表达与甲基化状态，分析其与患者临床特点的相关性，以及检测肺癌细胞株H23、H1299、L78、H446、H157及95D中TFF1的表达和甲基化状态以及5-aza-2'-deoxycytidine（DAC）处理后细胞株中TFF1表达的变化。TFF1转染H23细胞株，MTT法及克隆形成实验检测其增殖能力和克隆能力的变化，细胞凋亡实验及Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase3表达水平。结果TFF1在肺癌组织中的甲基化率为56．1%（55/98）。TFF1甲基化与肺癌患者的TNM分期和淋巴结转移显著相关（P＜0．001）。TFF1在H23和H157中无表达，在H1299、H446及95D中表达较低，在L78中表达较高。DAC处理后，细胞株TFF1表达的变化分别为表达恢复（H23、H157），表达增强（H1299，H446，95D）和无明显改变（L78）。恢复表达TFF1后，H23细胞株的增殖及克隆形成能力明显减弱（P＜0．05），细胞凋亡率和凋亡相关蛋白Caspase3活性片段的表达明显增加。结论TFF1在肺癌组织中的甲基化状态与肺癌的TNM分期和转移密切相关。TFF1在肺癌细胞中的表达受DNA甲基化的调控。肺癌细胞株H23中恢复表达TFF1可以抑制其增殖和克隆能力，促进其凋亡。

TFF1 肺癌 DNA甲基化 表观遗传学

1 材料和方法

1.1 人组织标本及细胞系 98例肺癌及癌旁组织来自宁波李惠利医院胸外科手术切除的肺癌患者，其中Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期60例。癌旁标本为距离肿瘤5cm远的肺组织，标本获取后立即放置到液氮中保存。肺癌细胞系H23、H1299、L78、H446、H157及95D，均购自ATCC，37℃，5%CO2孵箱中复苏、培养及传代。

1.2 DAC（5-aza-2′-deoxycytidine）处理 肺癌细胞系（H23、H1299、L78、H446、H157、95D）在处理前12h以低浓度（30%融合度）重铺于培养皿中，之后细胞用DAC（美国Sigma公司）处理，DAC终浓度为2 μmol/L，每24h换液，加药满96h收集细胞RNA。

1.3 提取RNA及 RT-PCR 采用Trizol（美国Life Technologies公司）法提取细胞总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计鉴定RNA的质量及浓度。提取的RNA在-80℃保存。5μg总RNA用来逆转录合成cDNA并稀释到100μl，取2.5μl稀释后cDNA进行PCR反应（25μl体系）。TFF1基因PCR引物序列如下：上游引物5′-CTGTTTCGACGACACCGTTC-3′，下游引物5′-TCTGGGACTAATCACCGTGC-3（华大基因），产物长度155bp，35个循环，GAPDH作为内参：上游引物：5′-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′（华大基因），25个循环。

1.4 DNA提取及硫化 冷冻标本迅速研磨后于加有蛋白酶K的DNA提取液TES中消化过夜，用酚氯仿法抽提，100%乙醇沉淀，75%乙醇洗2遍，TE稀释后分光光度计测定DNA浓度，-20℃保存备用。2μg DNA溶于50μl水中，50℃金属浴中重亚硫酸盐处理16h，DNA样本应用Wizard DNA Clean-Up系统纯化回收，氢氧化钠脱磺酸处理，乙醇洗涤后溶于20μl水中，-20℃保存备用。

1.5 MSP（methylation-specific PCR） MSP引物：U（非甲基化引物）：上游引物5′-TGGGTTTTGGTTAGGGTGTT-3′,下游引物5′-CTCATCCCTAACTCAAAATCA-3′，产物长度123bp，35个循环；M（甲基化引物）上游引物5′-TGGGTTTCGGTTAGGGTGTC-3′,下游引物5′-CTCATCCCTAACTCGAAATCG-3′，产物长度123bp，35个循环。每个MSP分析都包括一个阳性对照[体外甲基化DNA（IVD）]和一个阴性对照（正常人循环中淋巴细胞DNA）。MSP结果在2%琼脂糖凝胶电泳中分析。

1.6 TFF1和Vector转染H23细胞 胰酶消化H23细胞并计数，细胞铺6孔板，使其在转染日密度为90%。混合稀释的DNA和稀释的Lipofectamine2000（美国Invitrogen公司）来转染细胞，混合比例（1∶2/脂质体体积：DNA质量），室温下保温20min。将复合物加入到每孔中，轻轻混匀。37℃，5%的CO2中保温24h后将细胞传代至新鲜培养基中，2d后加入筛选抗生素G418，进行稳定表达，检测转染效率。

1.7 MTT增殖实验 转染TFF1和转染Vector满48h的H23细胞消化后以2 000个/孔铺在96孔板中，分别在0、24、48、72h通过MTT分析方法测定细胞增殖，每个时间段包括5个复孔，用酶标仪492nm波长处所测定OD值表示。

1.8 克隆形成实验 转染TFF1和转染Vector满48h的H23细胞消化后以500个/孔铺在6孔板中，同时用G418筛选阳性细胞，每3d换1次液，14d后采用75%冷乙醇固定细胞并用结晶紫染色，计数细胞所形成克隆数，统计分析。

1.9 细胞凋亡实验 转染TFF1和转染Vector满48h的H23细胞消化后用PI及Annexin V染色后于流式细胞仪中测定，分析早凋亡、晚期凋亡细胞所占细胞比例，统计分析其差异。

1.10 Western blot检测 收集转染TFF1和空载Vector 48h后的H23细胞，用预冷PBS洗涤后，立刻加入含有10%蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA裂解液并置于冰上裂解15min，4℃离心20min收集上清液，加入适量5×蛋白上样缓冲液，沸水煮5min后，SDS-PAG胶电泳后电转到PVDF膜上，牛奶封闭2h，一抗（cleaved caspase-3、βactin）室温孵育2h或4℃过夜后，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育1～2h，用增强发光液检测目的蛋白。

1.11 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件。采用Kendall相关系数分析相关性，计数资料的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 TFF1在肺癌细胞系中的表达与DNA甲基化的关系 RT-PCR检测显示TFF1在H23和H157中无表达，在H1299、H446及95D中表达较低，在L78中表达较高。DAC处理肺癌细胞系后，H23和H157中TFF1表达恢复，而H1299、H446及95D中TFF1表达增强，在L78细胞中TFF1的表达无明显改变。TFF1在肺癌细胞系H23和H157中呈完全甲基化，在H1299、H446及95D中呈半甲基化，在L78中为非甲基化状态（图1），说明TFF1在肺癌细胞系中的表达缺失或减低与DNA甲基化相关。

图1 TFF1在肺癌细胞系中的表达与DNA甲基化的关系（U：非甲基化；M：甲基化；NL：阴性对照；IVD：阳性对照）

2.2 TFF1在肺癌组织中发生甲基化的频率 应用MSP测定5例正常肺组织及98例肺癌组织中TFF1的甲基化状态，发现TFF1在5例正常组织中均为非甲基化状态，排除组织特异性，而TFF1在98例肺癌组织中的甲基化率为56.1%（55/98）（图2）。

图2 TFF1在肺癌组织中的甲基化状态（U：非甲基化；M：甲基化；NL：阴性对照；IVD：阳性对照）

2.3 TFF1甲基化与肺癌患者的TNM分期及淋巴结转移的关系 TFF1甲基化与肺癌患者的TNM分期显著相关（P＜0.001），同时TFF1甲基化与肺癌患者的淋巴结转移显著相关（P＜0.001），而与肺癌患者的性别、年龄以及肿瘤分化程度未见显著相关性，详见表1。

2.4 TFF1去甲基化后恢复表达与H23细胞的增殖及克隆形成能力的关系 TFF1去甲基化后可以明显的抑制H23细胞的增殖（P＜0.05）（图3A），H23细胞的克隆形成数在TFF1去甲基化后明显减少（P＜0.05）（图3B），说明TFF1的去甲基化可以抑制H23细胞的增殖及克隆形成能力。

2.5 TFF1去甲基化后恢复表达与H23细胞凋亡的关系 细胞凋亡实验结果显示TFF1去甲基化后H23细胞的凋亡率显著增加（图4A），Western blot结果显示凋亡相关蛋白Caspase3的活性片段的表达在TFF1去甲基化后恢复表达明显增加（图4B），说明TFF1去甲基化可以激活凋亡通路进而引起细胞凋亡的增加。

表1 TFF1甲基化与肺癌患者临床特点相关性分析

图3 TFF1去甲基化后的恢复表达可以抑制H23细胞的增殖及克隆形成（A：MTT增殖实验；B：克隆形成实验）

图4 TFF1去甲基化后恢复表达可以促进H23细胞的凋亡[（A：TFF1转染组细胞凋亡率显著高于空载（Vector）转染组（P＜0.05）；B：Western blot检测各转染组蛋白表达；D1：死亡细胞；D2：晚期凋亡细胞；D3：活细胞；D4：早期凋亡细胞]

3 讨论

肺癌是全球癌症相关死亡的最主要原因之一，其早期诊断率低、病死率高，严重威胁着人类的健康[1]。近年来越来越多的研究显示，DNA甲基化是肿瘤中抑癌基因表达缺失或降低的主要原因之一，在多种肿瘤的发生、发展中起到了重要作用[8-9]。也有研究显示表观遗传学的改变，尤其是抑癌基因的启动子区甲基化与肺癌的发生、发展有着密切的关系[10-11]。研究显示TFF1在多种肿瘤中如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌及上消化道癌的肿瘤形成及其转移相关[12-15]，而在胃癌中TFF1的表达受DNA甲基化的调控[16]。已有文章报道TFF1在肺癌中的表达及功能[17-19]，但是TFF1在肺癌中的表观遗传学改变及调控尚未见报道。本研究结果显示，TFF1在肺癌细胞中存在表达缺失及表达降低，经过DAC（去甲基化药物）处理后TFF1在肺癌细胞中的表达得到了恢复，与肺癌细胞中TFF1的甲基化状态相一致，表明TFF1在肺癌中的表达受DNA甲基化调控。在98例肺癌组织中，TFF1的甲基化率高达56.1%，TFF1在肺癌中呈现高甲基化，并且TFF1的甲基化状态与肺癌的TNM分期显著相关，提示TFF1的甲基化可作为早期肺癌诊断的潜在标志物。在肺癌细胞系H23中使TFF1去甲基化而恢复表达后可以抑制癌细胞的增殖和克隆形成，同时可以激活凋亡通路引起细胞凋亡的增加，起到抑癌作用。因此，TFF1可作为肺癌治疗的潜在靶标。

综上所述，TFF1在肺癌中的表达受DNA甲基化的调控，TFF1在肺癌中高甲基化与肿瘤TNM分期及淋巴结转移相关，使TFF1去甲基化后恢复表达可抑制H23细胞的增殖和克隆形成，并促进细胞的凋亡，起到抑癌作用。

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（本文编辑：严玮雯）

ObjectiveTo investigate the expression and methylation status of Trefoil factor 1(TFF1)in lung cancer tissues and lung cancer cell lines．MethodsExpression and methylation status of TFF1 in 98 non-small cell lung cancer(NSCLC) tissues and lung cancer cell lines(H23,H1299,L78,H446,H157 and 95D)were detected by RT-PCR and methylation specific PCR(MSP),respectively．The changes of TFF1 expression was also examined after the lung cancer cell lines treated with 5-aza-2'-deoxycytidine(DAC)．After H23 cells were transfected with TFF1 gene,the variation of proliferation and cloning ability of H23 cells was examined with MTT assay and colony formation,respectively．The apoptosis H23 cells was also determined and the expression of Caspase3 was detected with Western blot after transfection．ResultsThe methylation rate of TFF1 in lung cancer tissues was 56%(55/98)．TFF1 methylation was significantly correlated with TNM stage and lymph node metastasis in lung cancer patients(P＜0．001)．There was no expression of TFF1 in H23 and H157 cells,low expression in H1299,H446 and 95D cells,and high expression in L78 cells;after treatment of DAC,the expression of TFF1 was restored(H23 and H157),increased (H1299,H446 and 95D)or not changed(L78)．Transfection of TFF1 decreased proliferation and colony formation,promoted cell apoptosis rate and enhanced expression of Caspase3 in H23 cells．ConclusionThe methylation status of TFF1 in NSCLC tissue is closely related to TNM stages and metastasis of lung cancer．The expression of TFF1 in lung cancer is associated with DNA methylation．Restoration of TFF1 expression in lung cancer cells may suppress cell proliferation and accelerate cell apoptosis．

TFF1 Lung cancerDNA methylation Epigenetic

315040 宁波市医疗中心李惠利医院放疗科（刘开泰、陆妙珍），肾内科（褚宇东）

刘开泰，E-mail:lkt1982@126.com系统上皮中[4]。研究表明，TFF1在胃癌中起抑癌作用，TFF1在胃癌细胞中的表达受启动子区甲基化的调控[5]。TFF1与黏蛋白核心蛋白相互作用以稳定胃黏膜表面黏液凝胶层，对胃黏膜起保护和再生作用[6]。也有研究显示，TFF1表达与多种肿瘤如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌及上消化道癌的形成及转移密切相关[7]。因此，本文通过研究TFF1在肺癌中的表达和调控机制，探讨其在肺癌发生、发展过程中的作用，为肺癌的临床诊治提供参考。

2014-08-15）

肺癌是全球常见恶性肿瘤并且是导致癌症相关死亡的主要原因之一[1]。尽管传统的细胞学和影像学检测在肺癌的诊断中能起重要作用，但仍有67%的新诊断肺癌患者已经到了肺癌的较高阶段[2]。肺癌的发生是一个多相的过程，包括遗传学及表观遗传学的改变，其中DNA甲基化起到了重要的作用。抑癌基因的甲基化与表观遗传现象中的基因沉默密切相关[3]。寻找发生于启动子区甲基化的新功能基因是目前肺癌研究领域的热点之一，有助于理解肺癌发生过程中肿瘤抑制通路的分子机制，同时有助于找到肺癌的潜在诊断及治疗靶标。三叶因子（trefoil factor，TFF）家族是一组蛋白酶抵抗的肽段，包括TFF1、TFF2以及TFF3，均广泛表达于消化