徐轶彦

（福建卫生职业技术学院，福建 福州350025）

成纤维生长因子（Fibroblast growth factors FGFs）家族是一群具多种生理功能的生长因子，通过细胞表面的酪氨酸激酶受体将胞外信号传到胞内，其功能涉及胚胎发育、血管生成和伤口愈合等，对组织和细胞的增殖和分化起重要作用[1-2]。FGFs在哺乳动物中至少有22个成员，从FGF1~23，在人类中没有FGF15。FGF8是其中的一个成员，最初从雄激素依赖的小鼠乳腺癌细胞系SC-3克隆出来[3]。通过可变剪接，FGF8基因可转录加工成多种亚型。在小鼠中可产生FGF8a~h8种亚型，在人类中产生四种亚型：FGF8a、FGF8b、FGF8e和FGF8f[3-5]。本文利用大肠杆菌系统表达人FGF8a，并对表达的人FGF8a进行纯化、复性及体外活性检测。本研究将为进一步了解FGF8a的功能奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

含FGF8a cDNA序列的质粒pBluescript-FGF8a为本实验室保存；大肠杆菌Top 10′被用于分子克隆；大肠杆菌BL21(DE3)pLysS用于蛋白表达；T4DNA连接酶和限制性内切酶均购于TaKaRa公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow和Sephacryl S-200 HR购于美国通用公司；抗6×His一抗和碱性磷酸酶标记的二抗购于中杉金桥(北京)生物技术；其它试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 pET14b-FGF8a重组表达质粒的构建

以克隆有FGF8a cDNA序列的质粒pBluescript-FGF8a为模板，设计引物（上游引物：5′-GCCATATGGGCAGCCCCCGCTC-3′；下游引物：5′-CCGCTCGAGTTATCGGGGCTCGG-3′），扩增FGF8a阅读框序列。扩增的序列连接到载体pET14b的NheI/XhoI位点上，与6×His标签在同一阅读框。连接后的重组质粒转化TOP10′感受态细胞，涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上筛选。鉴定后的阳性转化子进行测序确定表达序列和阅读框的正确性。

1.2.2 重组人FGF8a在大肠杆菌中诱导表达

转化了pET14b-FGF8a重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS在LB培养基中培养过夜，过夜培养的细菌以1‰的接菌量接到新鲜的LB培养基中，培养至OD=0.3~0.6时，加入终浓度约1mmol/L的IPTG进行诱导表达4h。10000rpm 4℃离心10min，收集菌体，-20℃储存备用。

1.2.3 重组人FGF8a色谱纯化和复性

经IPTG诱导后的菌体进行超声破碎，7000rpm离心10min，收集包涵体。包涵体用20mmol/LTris-HCl，2mol/L尿素，2%TritonX-100洗涤30min，15000rpm离心10min，收集沉淀。洗涤后包涵体在室温下用20mmol/LTris-HCl，8mol/L尿素，0.1mol/L NaCl，pH8.0缓冲液进行溶解2h，15000rpm离心30min，取上清。Ni Sepharose 6 Fast Flow柱用上样缓冲液（20mmol/L Tris-HCl，8mol/L尿素，0.1mol/L NaCl，pH8.0）平衡。变性溶解后的上清以1ml/min的流速过Ni亲和柱，随后Ni柱用淋洗缓冲液（20mmol/LTris-HCl，8mol/L尿素，0.1mol/LNaCl，0.05mol/L咪唑，pH8.0）清洗非特异性吸附的杂蛋白。

采用在位复性的方式对变性后的重组人FGF8a进行复性。具体做法如下：吸附有重组人FGF8a的Ni亲和柱采用线性梯度的方式将尿素从8mol/L浓度逐渐下降到0mol/L，流速为0.1ml/min，梯度时间24h。随着尿素浓度的逐渐下降，吸附在Ni上的重组人FGF8a开始复性。最终柱上的重组人FGF8a用洗脱缓冲液（20mmol/LTris-HCl，0.1mol/L NaCl，0.5mol/L咪唑，pH8.0）进行洗脱。经Ni纯化的重组人FGF8a用Sephacryl S-200凝胶层析柱做进一步纯化和缓冲液更换。S-200 Sephocryl凝胶层析所用缓冲液为PBS，流速为1min/ml。收集重组人FGF8a洗脱峰，并用Bradford法对其进行蛋白定量。

1.2.4 重组人FGF8a Western blot鉴定

待测样品经12%SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上，条件100V，2h。5%脱脂奶粉封闭1h，在鼠抗6×His抗体中4℃孵育过夜。一抗孵育后的NC膜经TTBS清洗三次，每次10min。随后在碱性磷酸酶标记的二抗中孵育1h，膜清洗后用NBT/BCIP系统进行显色。

1.2.5 重组人FGF8a活性检测

按文献方法进行[6],将NIH3T3细胞以500个细胞/孔接种于96孔培养板，在含10%胎牛血清DMEM培养基中过夜培养后，去除未贴壁细胞，并向每孔中加入100μl的新鲜培养液。实验组中培养液中加入800μg/ml纯化后的FGF8蛋白，空白对照加入等体积的PBS溶液，每组实验重复5个复孔，培养24h后MTT法检测细胞增殖情况。

2 结果

2.1 人FGF8a表达载体的构建

利用特异性引物从克隆质粒pBluescript-FGF8a中扩增出FGF8a全长阅读框序列（图1）。扩增片段5′端含NheI位点，3′端含XhoI位点。PCR扩增片段经NheI和XhoI内切酶消化后与NheI和XhoI双酶切的原核表达载体pET14b进行连接，构建人FGF8a表达载体pET14b-FGF8a。表达载体中FGF8a序列在6×His序列下游，并与之同一阅读框。因此，表达的重组人FGF8a蛋白N端将带有6×His。表达序列与载体利用酶切技术对重组载体进行鉴定。连接载体经酶切鉴定正确后（图2），进行测序以确定表达序列和阅读框是否正确。

图1 PCR扩增的人FGF8a片段电泳分析

图2 FGF8a重组表达质粒限制性内切酶酶切鉴定

2.2 人FGF8a在大肠杆菌中有表达与纯化

转化了pET14b-FGF8a质粒的宿主菌BL21(DE3)pLysS用1mmol/L IPTG进行诱导表达，4小时诱导后在预期分子量大小的位置产生明显的蛋白条带（图3A）。Western blot鉴定该蛋白条带为重组FGF8a（图3B）。包涵体经8M脲变性溶解后过Ni亲和柱，并在柱上在位复性。Ni亲和柱洗脱峰再经Sephacryl S-200分子筛柱纯化。经Ni亲和柱和Sephacryl S-200分子筛柱纯化到的蛋白能被特异性抗原识别（图4B），且纯度达到电泳纯（图4A）。

图3 人FGF8a在大肠杆菌中表达

图4 人FGF8a纯化

2.3 重组人FGF8a活性检测

FGF在体外具有刺激细胞增殖的能力，据此特性，可对FGF的活性进行检测。传代培养24h后的NIH3T3成纤维细胞分别加入纯化后的重组FGF8a（800μg/ml）和PBS溶液，利用MTT法检测细胞的增殖情况，结果显示，与加PBS对照组相比，加入重组FGF8a后，NIH3T3细胞分裂增殖显著增加（图5）。

图5 重组人FGF8a活性检测

3 讨论

众多研究表明，不同的FGF8亚型在人类胚胎发育过程中，在多种不同组织中表达，对器官的发育与形成起着重要作用。为得到大量人FGF8a蛋白用于功能研究，我们尝试利用大肠杆菌系统表达人FGF8a。结果表明人FGF8a能在大肠杆菌中大量表达，但重组表达的FGF8a以包涵体形式存在。包涵体中的多肽不具高级构象，故无生理活性。为使大肠杆菌中表达的FGF8a有生理功能，可采用两种方式：第一对包涵体中的多肽进行体外复性；第二改变大肠杆菌的表达条件，增加胞质中可溶性FGF8a的含量[7]。第二种方法虽可避免包涵体复性过程的烦琐，但也产生了另外的问题，如表达量不高、增加纯化难度等。在本研究中，我们采用了柱上在位复性的方式，发现柱上复性后的FGF8a经洗脱后并不会出现沉淀现象，且整个复性过程操作简单。因此，柱上在位复性方式对于某些蛋白复性可能是一种不错的选择。

为方便纯化，我们在表达的人FGF8a蛋白N端增加了6×His标签，经Ni亲和柱和凝胶过滤两步色谱纯化后，重组蛋白纯度能达到电泳纯（图4）。纯化的重组人FGF8a处理NIH3T3细胞后，细胞增殖能力与对照相比明显增加，表明N端融合6×His标签的人FGF8a具有生理功能。

［1］Itoh N,Ornitz DM.Fibroblast growth factors:from molecular evolution to roles in development,metabolism and disease[J].JBiochem 2011,149(2):121-130.

［2］Ornitz DM,Itoh N.Fibroblast growth factors[Z].Genome Biol 2001,2(3):REVIEWS3005.

［］3Frank DU,Fotheringham LK,Brewer JA,Muglia LJ,Tristani-Firouzi M,Capecchi MR,Moon AM.An Fgf8 mouse mutant phenocopies human 22q11 deletion syndrome[J].Development 2002,129(19):4591-4603.

［4］Gemel J,Gorry M,Ehrlich GD,MacArthur CA.Structure and sequence of human FGF8[Z].Genomics 1996,35(1):253-257.

［5］Sunmonu NA,Li K,Li JY.Numerous isoforms of Fgf8 reflect its multiple roles in the developing brain[J].JCell Physiol 2011,226(7):1722-1726.

［6］Potula HH,Kathuria SR,Ghosh AK,Maiti TK,Dey S.Transient expression,purification and characterization of bioactive human fibroblast growth factor 8b in tobacco plants[J].Transgenic Res 2008,17(1):19-32.

［7］付灿.重组人成纤维细胞生长因子-8a在大肠杆菌中的可溶性表达[J].菏泽学院学报,2009,31(2):94-98.