高伟　陆静梅　牛陆　吴东梅　李岩　段肖

摘要：以耐盐型的通榆野生大豆和盐敏感型的辉南野生大豆植物叶片为试材，应用石蜡切片和植纹鉴定技术，对不同生态环境野生大豆叶片的解剖结构和表观植纹进行比较研究。结果表明，不同生态环境野生大豆叶片解剖结构存在明显差异，通榆野生大豆相对于辉南野生大豆叶片表皮细胞排列整齐，外切向壁角质层较厚，孔下室不明显，机械组织发达，栅栏组织较厚，平脉叶肉细胞多，主脉维管束导管分子较多，且出现异形维管束。植纹鉴定结果表明，尽管不同生态环境生长的野生大豆具有很高的同源相似性，但数理统计后的植纹特征显示出通榆野生大豆表观结构植纹更进化。通榆野生大豆具有拮抗盐逆境的演化结构。野生大豆植纹鉴定结果可为鉴别同属以及不同品系的同种植物提供科学依据。

关键词：野生大豆（Glycine soja）；石蜡切片；植纹；相关性；回归方程

中图分类号： S565.101 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0131-03

大豆原产于中国，是我国主要的经济作物之一。近年来，越来越多的科技工作者投身于大豆胁迫生理[1]、分子育种[2]等研究中来，但关于大豆解剖结构的研究相对较少，尤其将解剖结构和表观结构综合起来的研究更是鲜有发现。植物解剖结构具有稳定保守的特性[3]，以结构植物学的手段研究植物演化等问题是十分科学且必要的。植物叶片作为主要的营养器官直接影响着植物的生长，比根、茎等器官对不同环境的变化更为敏感，且会发生结构上的演化[4]。研究植物叶片的解剖以及表观结构能直接反映出该种植物适应不同环境所演化出的特征结构。本研究基于石蜡切片和植纹鉴定技术[5]，试图通过不同环境野生大豆叶片解剖和表观结构的差异，找到不同环境野生大豆植物结构的演化规律，旨在为我国大豆属植物拮抗逆境研究提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的野生大豆，分别为耐盐型的通榆野生大豆和盐敏感型的辉南野生大豆，由吉林省农业科学院大豆种质资源室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 石蜡切片方法 将供试材料放入FAA[甲醛 ∶ 冰乙酸 ∶ 乙醇（50%）= 1 ∶ 1 ∶ 18]中固定48 h后→乙醇梯度脱水→二甲苯梯度透明→浸蜡→包埋→切片→展片→二甲苯梯度脱蜡→番红-亮绿复染法染色→中性树胶（本试验采用加拿大树胶）封片[6]。

1.2.2 植纹鉴定方法 将供试叶片放入FAA中固定48 h后，刮取其下表皮使其成为半透明的膜状体，经乙醇梯度脱水后用二甲苯冲洗，最后用中性树胶封片制成永久装片[5]。

1.2.3 数据测定及分析 各试验装片均在Nikon Eclipse 80i显微镜下观察，并在选取合适的视野后进行显微拍摄。采用Nis-Elements图像分析系统中的Nis-Elements D 2.20，sp2（Build 243）Imaging Software软件测量叶片的各特征参数，试验结果为5次重复试验平均值，结果用“x±s”表示。运用SPSS 19.0软件进行数据统计学分析。

2 结果与分析

2.1 不同生态环境野生大豆叶片解剖结构比较

从表1、图1、图2看出，通榆野生大豆叶片厚度大于辉南野生大豆；通榆野生大豆叶片表皮细胞排列整齐，多呈长方形、圆形，外切向壁角质层较厚，孔下室相对辉南野生大豆不明显，且表皮细胞厚度大于辉南野生大豆；通榆野生大豆叶片机械组织相对辉南野生大豆更为发达；栅栏组织长度也表现为通榆野生大豆更长；平脉叶肉细胞数量通榆野生大豆叶片中更多；通榆野生大豆叶片主脉维管束有8列导管分子，维管束鞘细胞相对较大，且出现了异形维管束，辉南野生大豆叶片主脉维管束有5列导管分子，没有出现异形维管束；在木质部和韧皮部之间通榆野生大豆出现6团小薄壁细胞群，辉南野生大豆只有2团小薄壁细胞群。

2.2 不同生态环境野生大豆叶片植纹鉴定结果

2.2.1 植纹特征

2.2.1.1 植纹类型 光学显微镜下观察分析后发现，供试的

2个野生大豆叶片表观纹理表现为：与保卫细胞的排列方向一致的2个副卫细胞，分别在保卫细胞两侧并与其边缘相连，且2个副卫细胞大小不等。从而推断这种植纹类型为平列不等型[5]（图3、图4）。

2.2.1.2 表皮细胞垂周壁（径向壁）式样 Dilcher于1974年对植物表观形态进行了系统研究，并将表皮细胞垂周壁（径向壁）试样分为A～I型[7]。根据陆静梅[5]的相关研究，有理由将供试的野生大豆叶片表皮细胞垂周壁式样归纳为以A型为主（图3、图4）。

2.2.1.3 表皮及附属物 对野生大豆表皮附属物观察发现，供试的野生大豆叶片表皮毛均为单细胞毛。

2.2.2 植纹特征的统计学分析 在同倍数下（物镜40×，目镜10×）随机选取10个完整视野，记录每个视野的表皮细胞

数量和气孔器数量，然后用10个视野的平均细胞数量（E）和气孔数量（S）计算气孔指数（I），公式为：I=[S/（E+S）]×100。气孔密度换算为每mm2内的气孔个数。

从表2可以看出，保卫细胞长、宽和保卫细胞、副卫细胞及表皮细胞周长、面积等数据均显示出辉南野生大豆较通榆野生大豆大。根据Conover关于保卫细胞长度等级的参考标准[8]：小型（S） < 12 μm；中小型（MS） = 12～19 μm；中型（M）= 20～34 μm；大中型（ML） = 35～42 μm；大型（L） = 43～65 μm；非常大型（VL） > 65 μm。可以得出不同环境野生大豆植物保卫细胞长度等级介于MS和M之间，且表现为辉南野生大豆保卫细胞长度等级相对较高。

通榆野生大豆各植纹特征的相关分析结果见表3，其中保卫细胞周长与保卫细胞面积、附卫细胞周长、附卫细胞面积、表皮细胞周长、表皮细胞面积；保卫细胞面积与附卫细胞周长、附卫细胞面积、表皮细胞周长、表皮细胞面积；附卫细胞周长与附卫细胞面积、表皮细胞周长、表皮细胞面积；附卫细胞面积与表皮细胞周长、表皮细胞面积；表皮细胞周长与表皮细胞面积15对数据相关系数均大于0，且均满足P<0.01，差异极显著，说明组内二者存在极显著的线性正相关关系。辉南野生大豆各植纹特征的相关分析结果见表4，各组数据间均无显著相关关系。

对通榆野生大豆植纹特征参数，应用逐步回归法（stepwise），进行保卫细胞面积y对保卫细胞周长x1、保卫细胞长x2、保卫细胞宽x3的多元线性回归分析。结果表明，剔除2个不显著的偏回归系数对应的自变量保卫细胞长度（P=0.57>0.05）、保卫细胞宽度（P=0.62>0.05）后，最优方程为保卫细胞面积y对保卫细胞周长x1：y=-10.25+2.24x1，回归模型的复相关系数r=0.73。应用一元线性回归建立副卫细胞面积y对副卫细胞周长x的回归方程：y=-449.79+8.24x，回归模型的相关系数r=0.97。应用一元线性回归建立表皮细胞面积y对表皮细胞周长x的回归方程：y=24.97+6.13x，回归模型的相关系数r=0.89。

对辉南野生大豆植纹特征参数，应用逐步回归法进行保卫细胞面积y对保卫细胞周长x1、保卫细胞长x2、保卫细胞宽x3的多元线性回归分析。结果表明，剔除2个不显著的偏回归系数对应的自变量保卫细胞长度（P=0.65>0.05）和保卫细胞宽度（P=0.65>0.05）后，最优方程为保卫细胞面积y对保卫细胞周长x1：y=-43.55+2.86x1，回归模型的复相关系数r=0.71。应用一元线性回归建立副卫细胞面积y对副卫细胞周长x的回归方程：y=-533.01+8.93x，回归模型的相关系数r=0.94。应用一元线性回归建立表皮细胞面积y对表皮细胞周长x的回归方程：y=-26.65+7.05x，回归模型的相关系数r=0.87。

3 讨论

试验结果表明，通榆野生大豆表皮细胞排列整齐，外切向壁具有较厚的角质层，有利于植物叶片对光的折射，防止灼伤。通榆野生大豆叶片孔下室不明显，植纹数据表明，辉南野生大豆单个气孔平均面积较大，统计数据得出不同生态环境野生大豆气孔密度存在显著差异，经计算单位面积内气孔总面积表现为通榆>辉南，通过增加气孔数量增加叶片气孔总面积，在不影响植物正常进行生命活动的情况下，避免过度蒸腾导致植物失水。发达的机械组织增大了通榆野生大豆的机械支撑能力。其叶片的栅栏组织较多，且富含大量叶绿体，具有更强的光合能力。主脉维管束中导管分子的数量表现为通榆野生大豆较多，出现异形维管束，且平脉叶肉细胞数量也较辉南野生大豆更多，这些特征反映出通榆野生大豆相对于辉南野生大豆具有更强的疏导能力。木质部和韧皮部间小薄壁细胞群的出现扩大了营养吸收面积，小薄壁细胞团的数量，同样表现为通榆野生大豆更具优势。不同生态环境野生大豆叶片表观植纹特征无较大差异，验证了同属植物的同源相似性。统计后的数据显示出较大不同，相关性分析结果，通榆野生大豆各个植纹特征间存在极显著相关性，而辉南野生大豆各个植纹特征间无显著相关性。虽然不同生态环境野生大豆植纹特征参数间均可建立线性回归方程，但结果显示各线性回归方程均表现为通榆野生大豆拟合度更高。从而得出通榆野生大豆表观纹理的规律性更强，从简单到复杂，从无序到有序是进化的特征。研究结果证实通榆野生大豆演化出了拮抗盐逆境结构，将更适应盐胁迫环境。

同属植物的鉴别一直是植物分类的焦点，尤其是同种植物不同品系的区分更加容易混淆。野生大豆植纹鉴定结果显示出同属植物的同源相似性，统计后的植纹特征数据体现出同属植物的表观结构植纹差异，即使是同种植物的不同品系，其统计后的植纹特征数据也必然存在差异。应用植纹鉴定技术，可分别对植纹3个不同层次进行鉴别区分，即：（1）植纹特征；（2）量化后各植纹特征均值；（3）各植纹特征间独特的显著相关性和最优的回归方程[10]。研究结果表明，植纹鉴定手段对鉴别同属植物、不同品系的同种植物具有极高的科学性和准确性。有关大豆属植物分类、演化等问题还有待进一步深入研究。

参考文献：

[1]Tang Y L，Cao Y，Gao Z，et al. Expression of a vacuole-localized BURP-domain protein from soybean （SALI3-2） enhances tolerance to cadmium and copper stresses[J]. PLoS One，2014，9（6）：98830.

[2]Qiu L J，Xing L L，Guo Y，et al. A platform for soybean molecular breeding：the utilization of core collections for food security[J]. Plant Molecular Biology，2013，83（1/2）：41-50.

[3]王勋陵，王 静. 植物形态结构与环境[M]. 兰州：兰州大学出版社，1989.

[4]Cunningham S A，Summerhayes B，Westoby M. Evolutionary divergences in leaf structure and chemistry，comparing rainfall and soil nutrient gradients[J]. Ecological Monographs，1999，69（4）：569-588.

[5]陆静梅. 植物表观结构植纹鉴定[M]. 北京：科学出版社，2013.

[6]李正理. 植物制片技术[M]. 北京：科学出版社，1978.

[7]Dilcher D L. Approaches to the identification of angiosperm leaf remains[J]. The Botanical Review，1974，40（1）：1-157.

[8]Conover M V. Epidermal patterns of the reticulate‐veined Liliiflorae and their parallel-veined allies[J]. Botanical Journal of the Linnean Society，1991，107（3）：295-312.

[9]张 力. 在生物统计中的应用[M]. 厦门：厦门大学出版社，2013.

[10]高婷婷. 中国长白山乌头属5种植物表观结构植纹鉴定研究[D]. 长春：东北师范大学，2010.熊江波，肖金香. 不同干旱时长土壤含水率对烤烟烟碱含量的影响[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：134-136.