马素换 汪学德 李梦华

（河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

植物甾醇是一种重要的生理活性物质，对人的生理作用非常有益，它是植物油中一种重要的不皂化物。脱臭馏出物中含10%～30%的不皂化物，其中40%左右为甾醇［1－3］，因此多从脱臭馏出物中提取甾醇。常规的化学提取方法虽设备简单，但耗费溶剂量大，生产废料多，能量消耗大；新型超临界流体萃取法，环保干净，提取率高，但很多分子结构比较接近的物质会同时被萃取出来，造成产品纯度低［4－7］。本研究拟针对以上两种方法缺点，以芝麻油脱臭馏出物为原料，参照前人［8，9］研究的结果，在单因素试验的基础上，采用正交方法分别对溶剂法和超临界CO2法两种方法进行了工艺优化，使其更能广泛应用于生产上和实验室研究中，也以期为芝麻油脱臭馏出物的开发利用以及植物甾醇的生产加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器设备

超临界CO2设备：Helix-7409型，美国应用分离公司；

气相色谱—质谱联用仪：7890A-5975C型，美国Agilent公司；

分析天平：AL204型，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；

可见分光光度计：722N型，上海精科公司；

循环水式多用真空泵：SHZ-DⅢ型，巩义予华有限责任公司；

旋转蒸发器：RE-52A型，上海亚荣生化仪器厂；

恒温干燥箱：XMTD-8222型，上海精宏设备有限公司；

恒温水浴锅：XMTE-8112型，北京市永光明医疗厂。

1.1.2 试剂

氢氧化钾、石油醚：分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；

无水乙醇：分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司；

正己烷：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；

谷甾醇：纯度＞75%，Aladdin-阿拉丁试剂（上海）有限公司；

1.2 溶剂法提取单因素试验

（1）皂化时间对甾醇提取率的影响：在皂化温度85℃，加碱量7.5mL/0.5g，皂化时间1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.5h下考察皂化时间对甾醇提取率的影响。

（2）皂化温度对甾醇提取率的影响：在皂化时间3.5h，加碱量7.5mL/0.5g，皂化温度65，70，75，85，90，95℃下考察皂化温度对甾醇提取率的影响。

（3）加碱量对甾醇提取率的影响：在皂化时间3.5h，皂化温度85℃，加碱量5.0，6.5，7.5，8.5，10.0mL/0.5g下考察加碱量对甾醇提取率的影响。

单因素试验采用以下试验操作进行，以植物甾醇质量浓度为考察指标，每次试验做3次平行试验，结果取平均值。

试验操作：准确称取0.5g脱臭馏出物于锥形瓶中，加入一定量2mol/L KOH—无水乙醇溶液，剧烈振摇。在一定的温度下进行水浴皂化，皂化时间到达后加入5mL蒸馏水，使其停止皂化，取出锥形瓶，冷却至室温，加入5mL正己烷，进行萃取，避免剧烈摇晃而致使乳化，用同样量正己烷同样步骤萃取3次。

合并3次萃取液，加蒸馏水水洗至中性，加入一定的无水硫酸钠，放置一段时间除出残留水分，将萃取液倒入圆底烧瓶中，旋蒸除去溶剂［10－12］。用少量无水乙醇复溶，转移到100mL容量瓶中，定容。

用移液枪取出2mL于玻璃试管中，再各加入2mL无水乙醇和2mL显色剂，在涡旋混合器上涡旋30s，静置，显色15min后测吸光度。吸光度测定借鉴参考文献［9］。

1.3 超临界CO2法提取

1.3.1 工艺流程

芝麻油脱臭馏出物→称量上样→超临界CO2动静态结合萃取→馏出物萃取率分析

1.3.2 植物甾醇萃取率计算 按式（1）进行。

1.3.3 萃取法单因素试验设计 在CO2流量为20L/h，萃取压力为25MPa，萃取温度为50℃，萃取时间为2.5h的基础上从CO2流量、萃取压力、萃取温度和萃取时间4个因素去考查对甾醇提取率的影响［8］，各因素水平见表1。

表1 SCF－CO2萃取试验因素水平表Table 1 SCF－CO2extraction experiment factors level table

1.3.4 气质色谱分析条件

（1）色谱条件：HP-5毛细管色谱柱（30m×250μm×0.25μm）；进样口温度280℃；不分流；流速1.2mL/min；升温程序：90℃保持1min，以30℃/min的速率升温至270℃，保持1min，以3℃/min的速率升温至300℃，保持12 min；进样量1μL。

（2）MS条件：传输线温度250℃，离子源温度220℃，离子化模式为EI，电子能量70eV，分子离子碎片扫描范围（m/z）50～650。

2 结果与分析

2.1 溶剂法提取甾醇条件的选择

2.1.1 皂化时间对甾醇提取的影响 由图1可知，随皂化时间的延长甾醇得率提高，当皂化时间为3.5h时甾醇得率最高，为7.11%，但是皂化时间过长得率又会降低，因为皂化时间过长时会发生其他化学反应，溶出的物质与萃取剂渐渐结合，一方面影响甾醇的纯度，另一方面使最终结果偏低。而皂化时间过短时，皂化会不完全，甾醇不能从脱臭馏出物中完全脱离出来，并且游离脂肪酸、甘油酯等能溶解于正己烷使样品量偏高，从而使总甾醇含量较低。

图1 皂化时间对总甾醇含量的影响Figure 1 Saponification time on the influence of total sterol content

2.1.2 皂化温度对甾醇提取的影响 由图2可知，随皂化温度的升高甾醇得率增加，从65℃到75℃变化幅度较小，75℃到85℃变化幅度较大，当温度达到85℃时得到的甾醇最多，温度继续升高时甾醇含量降低，且降低速度较快，幅度较大，皂化温度的影响和皂化时间的影响相似。这可能是由于温度较低时物质活性低，不能皂化完全，皂化后溶液颜色加深，呈深褐色，萃取时溶剂的颜色也很深，为黄褐色，杂质进入甾醇中使结果偏低；温度过高时又可能使甾醇发生氧化，总甾醇含量减少。

2.1.3 碱液量对甾醇提取的影响 由图3可知，随加碱量的增加总甾醇量增多，加碱量为5.0，6.5mL/0.5g时差别不大，加碱量从6.5mL/0.5g到8.5mL/0.5g时甾醇得率增高较快，加碱量为10mL/0.5g比加碱量为8.5mL/0.5g得到的甾醇还要少一些，这是因为加碱量过少时不能使脱臭馏出物中的甾醇完全脱离出来，甾醇得率较低，若加碱量太高，甾醇损失也较多。为避免试剂的浪费和提高产率，应将料液比定为8.5mL/0.5g。

图2 皂化温度对总甾醇含量的影响Figure 2 Saponification temperature on the influence of total sterol content

图3 加碱液量对总甾醇含量的影响Figure 3 Alkaline effects on total sterol content

2.2 溶剂法正交试验优化结果

在单因素试验基础上，对皂化时间、皂化温度、碱液量进行三因素三水平正交试验设计，设计与结果见表2。

由表3可知，各因素对甾醇提取率影响的先后顺序：A＞C＞B，最优组合为A2B2C2，而9组试验最佳结果是8.58%，其组合为A2B1C2总甾醇含量能达到8.58%，提取率为27.16%，对组合 A2B2C2进行验证其总甾醇含量能达到8.63%，提取率为27.32%，考虑到降低热量消耗，同时提取结果又相对比较好，所以提取甾醇的最佳条件为组合A2B1C2：皂化时间3.5h，皂化温度80℃，加碱量8.5mL。时间越长、温度越高、碱液量越多，但甾醇得率不一定越好，因为这些条件的提高可能会使原料发生变化，部分杂质溶解在萃取剂中被萃取出来，使甾醇的纯度降低，同时降低了总甾醇含量。

表2 溶剂法正交L9（33）试验因素水平Table 2 Solvent method of L9（33）orthogonal test factors

表3 溶剂法正交L9（33）试验结果与分析Table 3 Results of solvent method of L9（33）orthogonal test

2.3 超临界CO2法提取甾醇条件选择

2.3.1 萃取压力对甾醇提取的影响 由图4可知，随着萃取压力的不断升高，甾醇提取率先增高后降低，在萃取压力为25MPa时，甾醇提取率最高，然后随着压力的增加，提取率反而下降，故选取萃取压力25MPa。

图4 萃取压力对甾醇提取率的影响Figure 4 Extraction pressure impact on sterol extraction

2.3.2 萃取时间对甾醇提取的影响 由图5可知，在萃取压力、温度和CO2流量一定的条件下，随着萃取时间的延长甾醇萃取率有明显增高的趋势，超过3h，提取率开始下降。

2.3.3 CO2流量对甾醇提取的影响 由图6可知，随着CO2流量的变化，甾醇萃取随之有明显的变化，流量大于20 L/h时，随着CO2流量的增加呈下降趋势，CO2流量大时流速大，会有部分物料随着CO2带出，从而导致物料中甾醇的部分损失，所以CO2的流量不能过大。

2.3.4 萃取温度对甾醇提取的影响 由图7可知，在相同压力下，随着温度的不断升高，CO2溶解能力先升高后降低，萃取温度为50℃时，甾醇提取率达最大值。温度继续升高，CO2溶解能力反而变小。

图5 萃取时间对甾醇提取率的影响Figure 5 Extraction time impact on sterol extraction yield

图6 CO2流量对甾醇提取的影响Figure 6 CO2flow impact on sterol extraction

图7 萃取温度对甾醇提取率影响Figure 7 Extraction temperature on sterol extraction yield

2.4 超临界萃取法正交试验结果与分析

超临界CO2萃取法正交因素水平和结果见表4、5。

表4 超临界CO2萃取正交L9（34）试验因素水平Table 4 The L9（34）orthogonal experiment test factors for supercritical CO2extraction

表5 超过临界CO2萃取正交L9（34）试验结果与分析Table 5 The L9（34）orthogonal experiment results for supercritical CO2extraction

由表5可知，各因素甾醇的提取率影响的主次顺序为：D＞C＞A＞B，最佳水平组合为A2B1C3D3，对其进行验证并与组合A2B1C2D3进行比较，结果为甾醇提取率分别为73.25%和72.69%，故超临界CO2最佳提取条件为：压力25 MPa，时间为2.5h，CO2流量为25L/h，温度为55℃。

2.5 芝麻油脱臭馏出物中甾醇的组成测定

色谱分析结果见图8，3个主峰依次为菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇。菜油甾醇前面那个小峰为菜籽甾醇，采用面积归一化方法，测定了各甾醇组分的质量分数，结果为菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、菜籽甾醇含量分别为19.32%，19.16%，42.40%，1.40%，甾醇纯度为82.28%。

3 结论

从芝麻油脱臭馏出物中提取植物甾醇其溶剂法的优化工艺条件为：皂化时间3.5h，皂化温度80℃，加碱量8.5mL/0.5g；超临界CO2萃取法优化工艺条件为：压力25 MPa，时间2.5h，CO2流量25L/h，温度55℃，此条件下产品的纯度为82.28%。

图8 甾醇气质色谱Figure 8 GC—MS pattern of standardized phytosterol

溶剂法每个操作过程会一定程度造成甾醇含量的损失，从试验结果也验证了溶剂法提取效果不如超临界CO2萃取法，但SCF—CO2法应用成本比溶剂法高，能否降低使用成本将直接影响其在工业生产中的广泛应用，未来将会尝试用夹带剂对超临界萃取过程进行强化，进一步缩短萃取时间，降低操作压力，降低其应用成本。

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