李倩云 张双灵 周国燕

（1.上海理工大学，上海 200093；2.青岛农业大学，山东 青岛 266109）

五倍子主要分布于中国的四川、湖南、湖北等地，是一种重要的经济中药材，可缓解肺热引发的咳嗽、常泄不止、痢疾不愈等［1］。单宁具有纯天然、效率高、安全无毒性、保护健康等优点，其利用价值很高，发展前景极其广阔。目前，测定五倍子中单宁的方法主要有紫外分光光度法、药典法（皮粉法）、HPLC法（高效液相色谱法）等［2］。药典法是各国同行认可的单宁酸测定方法，虽然其提取的试验结果较为稳定，但是所用的时间很长，过程复杂，不适合微量和低含量测定［3］。高效液相色谱法法操作简单迅速，具有较高的灵敏度，但需要较高的分析技能和高纯度的标准品，检测成本高［4］。在众多单宁含量的测定方法中，紫外分光光度法的应用最为广泛，具有简单、迅速等优点［5］，因此本试验采用此法进行测定。

超声波辅助提取方法具有操作简单快速、提取率高、花费少、安全等优势［6］，已广泛用在提取多种自然物质的研究中，如：超声波辅助提取锁阳多糖的工艺研究［7］，超声辅助法提取桑葚叶中的多糖［8］，超声波辅助提取酵母源类金属硫蛋白工艺的优化［9］，超声波辅助提取山豆根中的黄酮和多糖工艺优化［10］，超声复合酶法提取大蒜多糖的工艺优化［11］。从五倍子中提取单宁的工艺研究［12，13］较多，但报道的结果不尽相同。目前没有对盐酸体积分数、乙醇体积分数、超声温度及料液比4种因素同时进行研究的报道，本试验拟采用超声波辅助提取技术从五倍子中提取单宁，探究盐酸体积分数、乙醇体积分数、超声温度、料液比4个因素对超声辅助法提取五倍子单宁提取效率的影响，并利用正交试验优化工艺条件，从而为五倍子开发的工业化提供理论依据，为进一步研究单宁的生物活性提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

五倍子：肚倍，产于四川省德阳市，市售；

无水乙醇、单宁标准品、香草醛固体、甲醇、浓盐酸：均为市售分析纯。

1.2 主要仪器与设备

紫外分光光度计：754型，上海光谱仪器有限公司；

电子天平：AR224CN型，上海奥豪斯仪器有限公司；

超声波清洗器：KQ-500E型，昆山市超声仪器有限公司；

九阳粉碎机：JYL-0012型，上海高桥粉碎机厂。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理 首先挑选出饱满干净的五倍子，将五倍子破壳，去虫尸，取一定量的五倍子碎片粉碎，得五倍子粉末，将其放于棕色瓶中，干燥、避光保存，备用。

1.3.2 单宁的提取 分别称取多份1.0g的五倍子粉末，根据不同的料液比，用乙醇溶液溶解，辅助加入盐酸溶液，将其放在超声波清洗机内浸提，持续120s，完成后进行过滤，滤液转移到25mL的容量瓶中，加乙醇溶液到刻度线，摇晃均匀。准确移取2.50mL于具塞试管中，加入4%的香草醛溶液3.00mL，慢慢滴加1.50mL的浓盐酸，在无光常温条件下静放25min，于505nm处测量不同溶液的吸光度值，同时以空白试剂作参比。

1.3.3 单宁标准曲线的绘制 根据文献［14］，精密称量0.5 g单宁，用甲醇溶解并定容到50mL的容量瓶中，得到浓度为0.01g/mL的单宁标准溶液。依次量取0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00mL的单宁标准溶液放在6个25mL的容量瓶内，加甲醇溶液到刻度线，摇晃均匀。依次精密吸取以上各单宁溶液2.50mL放在6只具塞试管中，各加3.00mL的4%的香草醛溶液，慢慢滴入浓盐酸1.50mL，在无光常温下静放25min，于505nm处测吸光值，以空白试剂作为参比。纵轴是测得的各溶液的吸光度值，横轴是不同的单宁浓度，制作单宁的标准曲线。

1.3.4 单因素试验设计

（1）盐酸体积分数对五倍子单宁提取率的影响：称取1.0g五倍子粉末，加入70%的乙醇溶液，超声温度为50℃，料液比为1∶30（m∶V），盐酸体积分数分别为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，研究盐酸体积分数对五倍子单宁提取率的影响。

（2）乙醇体积分数对五倍子单宁提取率的影响：称量1.0g五倍子粉末，超声温度为50℃，料液比为1∶30（m∶V），盐酸体积分数为1.0%，乙醇体积分数分别为30%，40%，50%，60%，70%，研究乙醇体积分数对五倍子单宁提取率的影响。

（3）超声温度对五倍子单宁提取率的影响：称取1.0g五倍子粉末，盐酸体积分数为1.0%，70%的乙醇溶液，料液比为1∶30（m∶V），超声温度分别为40，50，60，70，80℃，研究超声温度对五倍子单宁提取率的影响。

（4）料液比对五倍子单宁提取率的影响：称取1.0g五倍子粉末，以70%的乙醇溶液为提取溶剂，盐酸体积分数为1.0%，提取温度为50℃，料液比分别为1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（m∶V），考察料液比对五倍子单宁提取率的影响。

1.3.5 正交试验设计 在单因素试验的基础上，选用L9（34）进行正交试验设计，每个试验重复3次。

1.4 五倍子单宁提取率测定

以五倍子为样品，用乙醇溶解，按照1.3.2方法在505nm波长下测吸光度。对照标准曲线，由回归方程可得单宁浓度。按式（1）求出五倍子单宁的提取率。

式中：

R——单宁提取率，%；

C——由标准曲线求得的单宁浓度，mg/mL；

V1——稀释体积，mL；

V2——样品溶液的体积，mL；

M——样品质量，g；

V3——吸取样品溶液的体积，mL。

1.5 数据统计方法

利用Spss17.0版软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 单宁的标准曲线 由单宁浓度（Cmg/mL）和吸光度值（A），得到单宁的标准曲线（见图1），拟合得到：A＝0.145 8C＋0.084 5，R2＝0.999 0，表明单宁质量浓度在1.0～4.0 mg/mL时具有良好的线性关系。

图1 不同浓度单宁吸光度值的标准曲线Figure 1 Standard curves of different concentration of tannin absorbance value

图2 盐酸体积分数对五倍子单宁提取率的影响Figure 2 Effects of volume fraction of HCl on the extraction rate of Gallic tannins

2.1.2 盐酸体积分数对五倍子单宁提取率的影响 由图2可知，盐酸体积分数对单宁的提取率有极显著影响（P＜0.01）。当体积分数为0.5%～1.0%时，单宁的提取率随着盐酸体积分数的增大而升高；但高于1.0%时，提取率不再呈上升趋势。说明盐酸的体积分数影响单宁的提取率，下降是由于乙醇—水体系不但能断裂单宁与金属离子的络合键，而且还能帮助断裂单宁和蛋白质、多糖以及其自身之间的疏水键和氢键。因此较优的盐酸体积分数为0.5%～1.5%。

2.1.3 乙醇体积分数对五倍子单宁提取率的影响 由图3可知，乙醇体积分数对单宁的提取率有显著影响（P＜0.05）。在乙醇体积分数为40%～50%时，单宁的提取率因乙醇的浓度变大而提高；高于50%时，提取率降低。原因是当乙醇体积分数增大时，乙醇溶液能够溶解的单宁的量也随之增大；下降可能是由于五倍子中某些物质释放出来抑制了单宁的溶解，所以较优的乙醇体积分数为40%～60%。

图3 乙醇体积分数对五倍子单宁提取率的影响Figure 3 Effects of volume fraction of ethanol on the extraction rate of Gallic tannins

图4 超声温度对五倍子单宁提取率的影响Figure 4 Effects of Ultrasonic temperature on the extraction rate of Gallic tannins

2.1.4 超声温度对五倍子单宁提取率的影响 由图4可知，超声温度对单宁的提取率有极显著影响（P＜0.01）。当超声波温度在40～50℃时，单宁的提取率会因温度的提高而增大；高于50℃时提取率不断降低。原因是当温度上升时，单宁等酚类物质活性提高，于溶剂里面的溶解度也会升高；下降是因为单宁的结构不够牢固，当处于较高的温度时会分解，或者容易被氧化；也可能是因为温度太高，导致细胞内的胶体等析出物数量上升，使溶液的粘稠度提高，阻碍了单宁的溶出。因此较优的超声温度为40～60℃。

2.1.5 料液比对五倍子单宁提取率的影响 由图5可知，料液比对单宁的提取率有显著影响（P＜0.05）。当料液比在1∶20～1∶30（m∶V）时，料液比渐渐升高，提取率亦会升高；大于1∶30（m∶V）时，提取率下降。原因可能是溶剂体积增多，与五倍子接触面积增大，使其中的单宁能与溶剂充分接触，从而提取率增大；下降是因为当料液比升高时，溶剂增多，单位体积内的单宁浓度会下降，易引发氧化作用。因此当不断提升料液比时，单宁的提取率会降低。因此较优的料液比为1∶25～1∶35（m∶V）。

图5 料液比对五倍子单宁提取率的影响Figure 5 Effects of Ratio of material to liquid on the extraction rate of Gallic tannins

2.2 正交试验结果

2.2.1 正交试验及结果分析 在单因素试验的基础上，选取盐酸浓度、乙醇浓度、超声温度、液料比4个因素设计正交试验。正交试验因素水平设计见表1，试验组合及结果见表2。

由表2中的极差分析能够得出，对五倍子单宁提取率影响由大到小的因素是：料液比＞超声温度＞乙醇体积分数＞盐酸体积分数，由K值大小可以选出最优水平组合为A2B2C1D2，即1.0%的盐酸溶液、50%的乙醇溶液、超声波温度为40℃、料液比1∶30（m∶V）。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Single factor selection table

表2 正交试验结果及极差分析Table 2 The results of orthogonal test and range

2.2.2 方差分析 由表3可知，当显著水平在0.05时，乙醇体积分数、超声温度、料液比对单宁提取率影响结果具有显著性 （P＜0.05）。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.2.3 验证实验 按照最佳方案A2B2C1D2进行验证实验，平行做3次，取平均值，测得五倍子中单宁的平均提取率为10.97%。该结果大于正交试验表中的最大值，因此A2B2C1D2为本试验的最优组合。

3 结论

本试验以单因素试验为基础，采用正交试验优化超声辅助提取五倍子单宁的工艺条件。研究表明盐酸体积分数、乙醇体积分数、超声温度可以显著影响五倍子单宁的提取效率，得到超声波辅助法提取五倍子中单宁最优工艺条件是：盐酸体积分数为1.0%、乙醇体积分数为50%、超声温度为40℃、料液比为1∶30（m∶V）。在此条件下，单宁的最大提取率为10.97%，提取率比文献［15］报道的7.32%明显提高。本研究得到的工艺条件可为工业提取单宁提供参考，为五倍子中单宁的进一步开发利用提供帮助。

1 周劲光.五倍子的药理作用与临床研究进展［J］.海峡药学，2010，22（2）：55～59.

2 王书园，俞凌云，朱云.单宁的分析研究现状［J］.开发与研究，2008，25（5）：16～19.

3 王全杰，任方萍，高龙.植物单宁的含量测定方法［J］.西部皮革，2010，32（23）：26～31.

4 吕翔，杨子祥，李杨，等.五倍子单宁含量测定方法的比较研究［J］.西南农业学报，2012，25（10）：80～84.

5 李晓文，严聃，盛灿梅.邻二氮菲—铁（Ⅲ）分光光度法测定茶叶中微量单宁［J］.食品与机械，2006，22（2）：90～101.

6 张宗和，闵凡芹，秦清，等.超声波辅助提取五倍子单宁酸的响应面优化试验［J］.生物质化学工程，2012，46（6）：12～16.

7 杨国伟，危晴，刘卉，等.超声波辅助提取锁阳多糖的工艺研究［J］.食品与机械，2013，29（3）：141～144.

8 Ying Zhi，Han Xiao-xiang，Li Jian-rong.Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves［J］.Food Chemistry，2011，127（3）：1 273～1 279.

9 李冰，王颖，徐炳政，等.超声波辅助提取酵母源类金属硫蛋白工艺的优化［J］.食品与机械，2014，30（3）：194～197.

10 赖红芳，黄秀香，陆俊宇.超声波辅助提取山豆根中的黄酮和多糖工艺优化［J］.食品与机械，2014，30（1）：196～198.

11 贯云娜，吴昊，杨绍兰，等.超声复合酶法提取大蒜多糖的工艺优化［J］.食品与机械，2014，30（1）：199～204.

12 江凯，李建科.五倍子单宁的超声提取工艺优化［J］.食品与发酵工业，2010，36（11）：194～197.

13 杜瑞莲，杨中林.五倍子中鞣质提取工艺研究［J］.中成药，2008，30（6）：839～841.

14 李永霞，王红，刘军海.超声波辅助提取五倍子中单宁［J］.化工技术与开发，2011，40（8）：18～21.

15 王红，李永霞，吕佳飞，等.响应面法优化五倍子单宁酸的超声波提取工艺［J］.湖北农业科学，2011，50（15）：69～72.