刘 玥 刘晓兰 郑喜群 周利敏

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

在玉米湿法淀粉加工过程中，可从淀粉乳中分离出5%～6%的玉米蛋白粉，玉米蛋白粉含蛋白质60%以上，玉米谷蛋白占其总蛋白含量的22%。玉米谷蛋白含大量酰胺基氨基酸，其中谷氨酰胺占总氨基酸的1/3［1］。谷氨酰胺是细胞增殖的主要能源，是增强肠免疫的重要营养物质；又是合成体内极其重要的抗氧化剂—还原型谷胱甘肽的前体物质［2］。玉米谷蛋白由于富含二硫键而不溶于水，可溶于稀酸或稀碱溶液［3］，此特点限制了其功能性质的发挥和应用。

生物体中活性自由基的积累会产生诸多破坏作用，如损伤细胞膜、使血清蛋白酶失去活性、损伤基因导致细胞变异、对机体造成衰老或引发其他疾病［4］。在食品加工及贮藏中，自由基会引起食品发生脂质过氧化，从而引起食品的变质。人工抗氧化剂可能存在潜在的健康风险，因此需迫切开发天然抗氧化剂。Suetsuna K、Pena-Ramos EA、王俊彤等［5－7］已分别在酪蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白中发现了许多抗氧化活性肽。目前未见复合蛋白酶（protamex）水解玉米谷蛋白酶解物抗氧化活性研究的相关报道。本研究拟采用Protamex水解玉米谷蛋白，探索水解时间对蛋白酶解物抗氧化活性的影响，以期为玉米谷蛋白在功能食品中的应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

玉米蛋白粉：黑龙江龙凤玉米开发有限公司；

Protamex复合蛋白酶：4.32×104U/g，诺维信公司；

其他试剂：分析纯；

pH计：PB-10型，北京伯乐生命科学发展有限公司；

双光束紫外可见分光光度计：TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司；

可见分光光度计：722s型，上海欣茂仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米谷蛋白酶解物的制备 将玉米谷蛋白按底物浓度5% （m/V）加入到磷酸盐缓冲液（pH 7.0，50mmol/L）中，50℃下按酶与底物之比为0.81∶100（m∶m）加入复合蛋白酶Protamex，向反应体系中滴加0.2mol/L NaOH溶液维持pH 恒定，控制水解时间分别为15，30，60，90，120，150 min。酶解反应后于沸水中灭酶30min，10 000r/min离心15min得酶解液，酶解液冷冻干燥待用。

1.2.2 玉米谷蛋白酶解物的水解度测定 采用pH-stat法［8］。

1.2.3 玉米谷蛋白酶解物分子量分布测定 凝胶柱Superdex Peptide 10/300GL安装于purifier100蛋白质色谱仪上，上样量100μL，流速0.25mL/min，检测波长214nm，流动相为 含 0.15mol/L NaCl的 磷 酸 盐 缓 冲 液 （pH 7.0，0.02mol/L），上样前标准蛋白于10 000r/min离心10min，并用0.22μm微孔滤膜过滤。测定蓝色葡聚糖2000和各分子量标准蛋白（Aprotinine、杆菌肽、氧化型谷光甘肽、还原型谷光甘肽）的洗脱体积（Ve）。根据标准蛋白的凝胶过滤洗脱曲线，做标准蛋白分子量对数（lgMr）与可用分配系数（Kaw）关系的标准曲线，其中Kaw＝（Ve－V0）/（Vt－V0）。由于蓝色葡聚糖2000在Superdex Peptide 10/300GL色谱柱上被完全排阻，其洗脱体积Ve相当于色谱柱外水体积V0，柱床总体积Vt为24mL。根据各分子量标准的洗脱体积，计算相应Kaw，做标准蛋白分子量对数（lgMr）与可用分配系数（Kaw）关系的回归方程。

玉米谷蛋白酶解物（2mg/mL）用流动相溶解，10 000r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，上样量100μL，流动相进行洗脱，流速0.25mL/min，检测波长214nm。根据玉米谷蛋白酶解物凝胶过滤洗脱体积，计算相应Kaw，根据标准蛋白分子量对数（lgMr）与可用分配系数（Kaw）关系的回归方程，计算玉米谷蛋白酶解物的分子量。

1.2.4 玉米谷蛋白酶解物抗氧化活性测定

（1）清除DPPH自由基活性的测定：根据文献［9］，修改如下：取2mL玉米谷蛋白酶解液（2mg/mL），加入2mL DPPH无水乙醇溶液（0.1mmol/L），混合均匀，避光反应30 min，在517nm处测其吸光值（Ai）；取2mL玉米谷蛋白酶解液于试管中，加入2mL无水乙醇，在517nm处测其吸光值（Aj）；取2mL DPPH 无水乙醇溶液（0.1mmol/L）和2mL无水乙醇反应作为参比，在517nm处测其吸光值（A0）。0.01mg/mL的VC溶液作为对照。样品对DPPH自由基的清除率K按式（1）计算：

式中：

K——对DPPH自由基的清除率，%；

A0——2mL DPPH 无水乙醇溶液（0.1mmol/L）与2 mL无水乙醇在517nm下的吸光值；

Ai——2mL DPPH 无水乙醇溶液（0.1mmol/L）与2 mL样品溶液反应在517nm下的吸光值；

Aj——2mL无水乙醇与2mL样品溶液在517nm下的吸光值。

（2）清除羟基自由基（·OH）活性的测定：根据文献［10］，修改如下：取2mL玉米谷蛋白酶解液（2mg/mL），依次加入2mL FeSO4（6mmol/L）、H2O2（6mmol/L），混匀后静置10min，再加入2mL水杨酸 （6mmol/L），混匀，静置30min，在510nm处测定吸光值（Ai＇）。用去离子水代替水杨酸重复以上操作测定510nm处的吸光值（Aj＇），用去离子水代替样品重复以上操作测定510nm处的吸光值（A0＇）。0.01mg/mL的VC溶液作为对照。样品对羟基自由基的清除率Y按式（2）计算：

式中：

Y——对羟基自由基的清除率，%；

Ai＇——样品溶液在510nm处的吸光值；

A0＇——去离子水代替样品在510nm处的吸光值；

Aj＇——去离子水代替水杨酸在510nm处的吸光值。

式中：

I——对超氧阴离子自由基的抑制率，%；

V空白——空白组邻苯三酚自氧化速率，A/min；

V样品——样品组邻苯三酚自氧化速率，A/min。

（4）还原力测定：根据文献［12］，修改如下：取2mL玉米谷蛋白酶解液（2mg/mL），分别加入2mL磷酸盐缓冲液（pH 6.6，0.2mol/L），2mL质量分数为1%的铁氰化钾（K3Fe（CN）6）溶液，混匀，在50℃水浴下保温20min，再加入2 mL质量分数10%的三氯乙酸（TCA）溶液，震荡摇匀后以4 000r/min离心10min。取离心后上清液2mL，加入2mL去离子水和0.4mL质量分数为0.1%的FeCl3溶液，震荡摇匀后在50℃水浴下保温10min，在700nm波长下测定溶液的吸光值。以去离子水代替样品重复以上操作作为空白，0.01 mg/mL的VC溶液作为对照。

（5）与亚铁离子螯合能力的测定：根据文献［13］，修改如下：取1mL玉米谷蛋白酶解（2mg/mL）液加入2mL FeCl2（20μmol/L），混 匀 后 加 入 2mL 菲 洛 嗪 溶 液 （0.5mmol/L），剧烈震荡摇匀，室温下静置10min，在563nm处测定吸光值（A样品），以去离子水代替玉米谷蛋白酶解液作为空白（A空白）。0.01mg/mL的 VC溶液作为对照。样品与亚铁离子的螯合率按式（4）计算：

式中：

Y——与亚铁离子的螯合率，%；

A样品——样品溶液参加以上反应测定563nm处的吸光值；

A空白——去离子水参加以上反应测定563nm处的吸光值。

1.3 数据分析

试验中数据都是3次测定的平均值，以平均值±标准差表示，采用IBM SPSS Statistics 19软件中的单因素方差分析（One-way AVONA）和Duncan多重比较法进行数据统计学分析，P＜0.05为差异显著，用Excel 2003软件绘制图示。

2 结果和讨论

2.1 水解时间的影响

由表1可知，Protamex水解玉米谷蛋白反应时间在15～150min内，水解度变化缓慢，但酶解物的分子量分布变化较大。水解时间为15min时，酶解物中分子量大于6 511Da的蛋白组分占82.39%；水解时间为120min时，酶解物中分子量6 511.51～307.32Da的组分占94.36%。即随着水解时间的延长，大分子量蛋白含量逐渐降低，小分子量蛋白含量逐渐增加。

表1 Protamex酶解玉米谷蛋白水解时间与其水解度和分子量分布关系Table 1 Hydrolysis degree and molecular weight distribution of corn glutelin hydrolysate by Protamex during hydrolysis process

2.2 清除DPPH自由基的活性

由图1可知，Protamex酶解玉米谷蛋白时，不同水解时间的酶解物对DPPH自由基都具有清除作用，但清除能力有差异，显著性分析结果表明水解时间在15～90min范围内的差异不大。水解时间为120min时，酶解物对DPPH自由基的清除率达到最大值，为（58.86±1.40）%，该值与0.01mg/mL的Vc溶液对DPPH自由基的清除率相当，且显著性分析结果表明该值与Vc溶液对DPPH自由基的清除率之间无显著性差异。这个结果表明，玉米谷蛋白酶解物中大分子量和小分子量肽段均具有对DPPH自由基的清除活性，水解时间为120min时，酶解物中的大分子量和小分子量的肽段均达到对DPPH自由基清除率的最大值，酶解过程中可能产生具有供氢能力的氨基酸如色氨酸和酪氨酸。在水解时间为150min时，酶解物对DPPH的清除率反而降低，可能原因是酶解产物由于过度水解，大分子量的肽段继续水解成小分子的肽段，从而使对DPPH自由基具有清除能力的肽段被破坏，具有活性的氨基酸含量降低。酶解物的分子量和水解时间与对DPPH自由基的清除率高低不具有相关性［14］，过度水解其对DPPH自由基清除能力反而下降。

图1 Protamex酶解玉米谷蛋白水解时间与酶解物对DPPH自由基清除率的关系Figure 1 Relation between hydrolysis time and DPPH radical scavenging activities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

2.3 清除羟基自由基的活性

图2 Protamex酶解玉米谷蛋白水解时间与酶解物清除羟基自由基活性的关系Figure 2 Relation between hydrolysis time and hydroxyl radical scavenging activities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

由图2可知，Protamex酶解玉米谷蛋白时，不同水解时间的酶解物对羟基自由基都有很强的清除率。水解时间为15min时，酶解物已经显示出对羟基自由基的清除能力，此时清除率达到（82.89±1.53）%；水解时间在30～60min内酶解物对羟基自由基清除率变化不大，水解时间为120min时，酶解物对羟基自由基的清除率达到（82.64±0.75）%，而作为对照的Vc溶液对羟基的清除率为（34.09±1.33）%。结果表明，低浓度的酶解物在水解反应初期（水解时间为15 min时）具有很好的对羟基自由基的清除效果，可能原因是酶解反应过程中，玉米谷蛋白致密的结构被破坏，具有抗氧化活性的基团部分暴露出来，其中分子量大于6 511.51Da的肽段清除羟基自由基活性为主要作用，该水解度下生成具有清除羟基自由基的重要肽段。随着水解时间延长，水解时间在90和120min时，分子量在6 511.51～307.32Da的肽段清除羟基自由基活性为主要作用。水解时间为150min时，分子量在6 511.51～307.32Da的肽段被水解成更小的肽段，破坏了具有清除能力的肽段，使其清除羟基自由基活性下降。显著性分析结果表明水解时间为15，90，120min的酶解样品之间无显著性差异，酶解物的分子量和水解时间与其清除羟基自由基能力不存在相关性，与其具有活性的肽段有关。

2.4 清除超氧阴离子（·）的活性

2.5 玉米谷蛋白酶解物的还原力

由图4可知，Protamex酶解玉米谷蛋白时，各水解时间的酶解物均有较高的还原力。水解时间为90，120min时，酶解物的还原力较高分别为0.234±0.003和0.236±0.004，该值和0.01mg/mL的Vc溶液相当。显著性分析结果表明各水解时间的酶解物还原力相差不大，均有良好的抗氧化能力，与水解时间和水解度没有一定的相关性，可能原因是酶解过程中Protamex的作用位点广泛，专一性不强，酶解物中所含抗氧化肽结构、氨基酸组成及序列差异不大。

图3 Protamex酶解玉米谷蛋白水解时间与酶解物对超氧阴离子抑制活性的关系Figure 3 Relation between hydrolysis time and superoxide anion scavenging activities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

图4 Protamex酶解玉米谷蛋白水解时间与酶解物还原力的关系Figure 4 Relation between hydrolysis time and reducing powers of corn glutelin hydrolysate by Protamex

2.6 玉米谷蛋白酶解物与亚铁离子螯合的能力

由图5可知，Protamex水解玉米谷蛋白时，各水解时间的酶解物与亚铁离子均有一定的螯合能力。水解时间为15 min时，酶解物即具有与亚铁离子的螯合能力，肽键断裂，暴露出具有活性的氨基酸，如组氨酸是常见的具有与金属螯合能力的氨基酸。延长水解时间对亚铁离子螯合能力提高显著，酶解时间120min时，酶解物与亚铁离子螯合能力达到最高值为（29.92±2.96）%，而Vc溶液对亚铁离子几乎没有螯合作用，这与杨双等［15］的报道一致。玉米谷蛋白酶解物与亚铁离子的螯合能力虽然不高，但是可以在一定程度上减缓蛋白质被氧化，是非常重要的天然抗氧化剂。

图5 Protamex酶解玉米谷蛋白水解时间与酶解物与亚铁离子的螯合能力的关系Figure 5 Relation between hydrolysis time and Fe2＋-chelating abilities of corn glutelin hydrolysate by Protamex

3 结论

研究结果表明，Protamex水解玉米谷蛋白时，各水解时间下酶解物都具有抗氧化活性，抗氧化能力都有差异。酶解物的抗氧化活性与水解时间和水解度没有相关性，酶解物中大分子肽段和小分子肽段均具有一定的抗氧化活性。Protamex酶解时间为120min时的酶解物具有较高的抗氧化活性，可能与其活性肽段有关，因此通过控制Protamex水解玉米谷蛋白的时间可以得到具有高抗氧化活性的酶解物，将对玉米谷蛋白的应用奠定良好的基础。其中Protamex水解玉米谷蛋白的水解度和分子量分布与其抗氧化活性的关系需要进一步的试验。

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