李裕博 纪晓琳 刘 山 查 越 辛丘岩 启 航

（1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034）

黄海海燕（Asterinapectinifera）俗称海星，属海星纲有棘目海燕科，常见于中国黄海、渤海一带，是分布广泛的海洋生物资源之一［1］，主要以扇贝、鲍鱼、海胆等海珍品为食，对沿海的水产养殖造成巨大的危害。黄海海燕除含有蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、微量元素和维生素等外，还含有大量结构独特且具有生物活性的代谢产物，具有良好的生理活性和药理活性［2］。由于海洋动物的生长环境特殊，其在生理和药理方面具有陆地生物所没有的活性物质如海燕皂苷、海参皂苷、虾青素、深海鱼油、鲎素，在抗氧化活性的研究方面具有潜在价值。到目前为止，具有抗氧化活性的酶解物已经从许多类型的海洋生物中提取出来，例如鱼类［3］、鱿鱼［4］、虾类［5］、棘皮动物［6］和双壳类软体动物［7］。

刘小玲等［8］利用蛋白酶对罗非鱼鱼皮进行酶解，经试验表明，鱼皮胶原肽对羟基具有一定的清除能力，且随着胶原肽浓度的增加而增大。王莅莎等［9］经Sephadex G-100凝胶过滤柱从雌、雄鲍鱼脏器粗多糖中各分离出两种多糖组分，经测定其清除羟基自由基的IC50分别为1.38，0.99，1.51，1.19mg/mL。任俊凤等［10］通过木瓜蛋白酶酶解河豚鱼皮提取胶原蛋白肽，并对其抗氧化活性进行了研究，确定蛋白肽具有清除自由基的能力。盘赛昆等［11］通过对鳙鱼肉进行酶解制备抗氧化活性肽，结果表明，酶解物对羟基自由基的最高清除率可达到91.2%。张爽等［12］对鲍鱼外套膜酶解物进行了抗氧化活性的研究，测定酶解物清除DPPH自由基和羟基自由基的IC50分别为11.76，12.07mg/mL。周大勇等［13］利用胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶对鲍鱼内脏进行酶解，测得3种酶解物对DPPH自由基清除率的IC50值均为4 mg/mL，对羟基自由基清除率的IC50值分别为8，4，5mg/mL。顾明广等［14］对鱼皮胶原蛋白进行酶解制备抗氧化肽，抗氧化活性试验结果表明，小分子量胶原蛋白清除DPPH自由基的能力由原胶原蛋白的26%提高到74%。

电子自旋共振（electron spin resonance，ESR）又称电子顺磁共振，是在磁场中测量临界状态下未成对的电子的理论基础上发展而来［15］，可以探测和识别具有未成对电子的分子，是检测自由基最直接最有效的方法［16］。氧自由基容易引起细胞损伤，导致疾病发生，对机体危害极大。本试验主要以黄海海燕体壁为原料制备酶解物，应用ESR技术检测粗酶解物对DPPH自由基和羟基自由基的清除作用，对不同酶种所得酶解物的清除效果进行了对比，以期为黄海海燕体壁酶解产物在保健食品开发相关领域的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 材料与试剂

黄海海燕（Asterinapectinifera）：大连太平洋海珍品有限公司；

胃蛋白酶：13 274U/g，上海生工生物股份有限公司；

胰蛋白酶：103 405U/g，上海生工生物股份有限公司；

中性蛋白酶：75 000U/g，南宁庞博生物工程有限公司；

DPPH：美国sigma-aldrich公司；

DMPO：优级纯，上海阿拉丁试剂有限公司；

其余试剂：均为国产分析纯试剂。

1.1.2 主要仪器设备

冷冻离心机：RC-6plus型，美国Virtis公司；

真空冷冻干燥机：ZKBTES-55型，美国Virtis公司；

干燥箱：PH070A型，上海一恒科技有限公司；

集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S型，予华仪器有限公司；

酶标仪：infiniteM200型，瑞士TECAN公司；

pH计：PB-10型，赛多利斯科学仪器有限公司；

电子顺磁共振波谱仪：A200型，德国Bruker Opertics公司。

1.2 方法

1.2.1 黄海海燕的预处理 新鲜黄海海燕，去除内脏，自来水清洗干净后，于干燥箱中烘干。用1mol/L HCl浸泡，每6 h更换一次HCl，直至不再产生气泡，用去离子水洗至中性，在干燥箱（80℃）中干燥24h后粉碎备用。

1.2.2 酶解液的制备 将8g粉碎后的黄海海燕体壁粉与100mL水混合，分别在胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶的最适条件下（胃蛋白酶37℃，pH 2.0；中性蛋白酶45℃，pH 7.0；胰蛋白酶37℃，pH 8.0）按照2 500U/g·底物加入酶，酶解3h，酶解结束后置于沸水浴中灭酶10min，4 000r/min离心20min，取上清冷冻干燥后将3种酶的酶解物按照浓度为10，20，30，40，50mg/mL的梯度配成酶解液，置于－80℃冰箱中保存，备用。

1.2.3 肽得率的测定 将经过酶解的粗酶解液与10%TCA按照1∶1的比例混合均匀，静置30min后，采用福林酚法测定肽得率［17］。

1.2.4 酶解液清除DPPH自由基活性测定 200μmol/L的DPPH溶液和不同浓度的粗酶解液混合，避光保存30 min，立即吸入毛细管，放入谐振腔，在中心磁场强度3 368.6 G；微波功率5.32mW；微波频率9.44GHz；放大倍数1.42×104；调制幅度1.0G；调制频率100kHz；时间常数81.92 ms；转换时间40ms条件下扫描。空白组中粗酶解液用去离子水代替。以波谱信号第3个峰高值表示信号的相对强度，按式（1）计算清除率：

1.2.5 酶解液清除羟基自由基活性测定 将不同浓度的粗酶解液与羟基自由基体系混合，40℃水浴30min，立即吸入毛细管，放入谐振腔，在中心磁场强度3 369.08G；微波功率74.8mW；微波频率9.44GHz；放大倍数1.00×105；调制幅度1.0G；调制频率100kHz；时间常数163.84ms；转换时间160ms条件下扫描，空白组中粗酶解液用去离子水代替，以波谱信号第2个峰高值表示信号的相对强度，按式（1）计算清除率：

1.2.6 统计学分析 试验中做3组平行，数据用平均值±标准偏差的方式表示，利用SPSS对所得数据进行统计分析，使用单向方差分析，P＜0.05被认为是显著的。

2 结果与讨论

2.1 黄海海燕体壁酶解物肽得率

由图1可知，在中性蛋白酶和胰蛋白酶二者之间没有显著性差异，胃蛋白酶与其他两种酶存在显著性差异。此结果中胃蛋白酶组数据与黄鹏等［18］用胃蛋白酶酶解沙棘粕制备生物活性肽报道的肽得率4.58%大致相近；但与赵鸿霞等［19］报道用中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解海参卵所得肽得率50.49%和30.51%的相比较低。

图1 3种蛋白酶对黄海海燕体壁进行酶解的肽得率Figure 1 The rate of peptide from the body wall of starfish Asterina pectinifera using the three proteases

2.2 酶解液对DPPH自由基的清除作用

本试验采用电子自旋共振（ESR）技术分别检测不同浓度的黄海海燕体壁酶解液对DPPH自由基的清除效果，3种酶解液（胃蛋白酶组、中性蛋白酶组和胰蛋白酶组）对DPPH自由基都具有一定的清除效果（图2），而且清除效果随着酶解液浓度的升高而增强（图3）。胃蛋白酶组、中性蛋白酶组和胰蛋白酶组对DPPH自由基清除能力的IC50值分别为19.68，17.71，21.23mg/mL，对于较高浓度的黄海海燕体壁酶解液，中性蛋白酶的酶解液均具有较强的清除能力（P＜0.05）。赵雅娉等［20］利用胃蛋白酶对黄海海燕体壁进行酶解制备胶原蛋白肽并对其抗氧化活性进行了研究，结果证明，酶解物浓度为20mg/mL时胃蛋白酶酶解物对DPPH自由基的清除率为52%，这与本试验中IC50值相近。

图2 3种蛋白酶酶解物对DPPH自由基的清除率Figure 2 The determination of scavenging rate of the three kinds of hydrolysate on DPPH radical

图3 酶解物对DPPH自由基清除作用的ESR图谱Figure 3 ESR spectrum of effects of hydrolysate on DPPH radical scavenging

2.3 酶解液对羟基自由基的清除作用

本试验采用电子自旋共振（ESR）技术检测黄海海燕体壁对粗酶解液对羟基自由基的清除效果，3种酶解液（胃蛋白酶组、中性蛋白酶组和胰蛋白酶组）对羟基自由基都具有一定的清除效果，如图4所示，而且清除效果随着酶解液浓度的升高而增强（清除率由ESR峰值计算，如图5所示），胃蛋白酶组、中性蛋白酶组和胰蛋白酶组对羟基自由基的清除能力的IC50值分别为15.17，11.94，16.65mg/mL。胃蛋白酶和中性蛋白酶酶解物对羟基自由基清除率没有显著差别（P＜0.05），但是在10mg/mL和20mg/mL条件下，中性蛋白酶组对羟基自由基具有显著较高的清除率。

图4 3种蛋白酶酶解物对羟基自由基的清除率Figure 4 The determination of scavenging rate of the three kinds of hydrolysate on hydroxyl radical

图5 酶解物对羟基自由基清除作用的ESR图谱Figure 5 ESR spectrum of effects of hydrolysate on hydroxyl radical scavenging

3 结论

本试验结果表明，由胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解黄海海燕体壁所得到的酶解物对DPPH自由基和羟基自由基都具有很好的清除作用，可以作为抗氧化清除自由基的良好原料。并且中性蛋白酶酶解物对DPPH自由基和羟基自由基具有明显的清除能力，其对DPPH自由基和羟基自由基清除能力的IC50值分别为17.71，11.94mg/mL。黄海海燕体壁酶解液为开发新型功能性海洋食品基料提供了一定的理论依据，将提高黄海海燕的利用价值，并将扩展ESR技术在水产品加工与检测方面的应用。

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