黄百祺，杨昭，王如意，黄创成，吴巨贤，邹琴*

(1.广东科贸职业学院 食品与生物工程学院，广州 510430；2.广东食品药品职业学院实验实训中心，广州 510430；3.四会市康源水产养殖场，广东 肇庆 526200)

广东省是我国龟鳖类动物养殖规模最大的省份之一。据统计，广东省食用龟养殖存量上中国龟种以黄喉拟水龟(Mauremysmutica，俗称石金钱，以下简称石龟)最多，其次为中华草龟(Chinemysreevesii，以下简称草龟)、中华花龟(Ocadiasinensis，以下简称花龟)，外国龟种以鳄龟(Chelydraserpentina)最多[1]。研究表明，石龟、草龟、花龟、鳄龟肉粗蛋白含量约为17%[2-4]，其氨基酸组成比例符合FAO/WHO的推荐标准，是一种高蛋白、低脂肪的肉类和优质的蛋白质来源。目前，对这4种龟肉的利用仍以鲜食为主，随着养殖技术不断提高和规模逐步扩大，以及对龟肉生理活性作用的深入研究[5]，人们对龟肉食用价值的认识进一步提高，对龟肉深加工制品也提出了新的要求。酶解技术是制备肉类衍生化、高值化深加工产品的有效方法之一。肉类经酶水解后产生大量溶解性好、易于吸收消化的短肽和游离氨基酸，其在一定条件下能与还原糖、脂类等物质发生反应，产生肉味和烹调效果的香气[6]。

利用酶解技术制备肉类水解蛋白时，由于不同蛋白酶在水解方式和酶切位点上存在差异，导致酶解产物中游离氨基酸的组成和含量不同，直接影响其风味，故蛋白酶的选择至关重要[7]。复合蛋白酶既有内切酶，也有外切酶，利用其制备酶解产物时在风味、氨基酸含量等方面具有一定优势。徐永霞等[8]选用复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等对蓝蛤进行单酶酶解，结果表明复合蛋白酶组中游离氨基酸总量最高，酶解液的风味较佳；李冬梅等[9]研究了不同蛋白酶对虾头水解物风味的影响，发现复合蛋白酶水解液中的多肽含量及其美拉德反应产物中的鲜味氨基酸含量最高；陈宇等[10]研究发现经复合蛋白酶处理的卤鸭在色泽、形态等感官指标方面较单一酶更佳。

目前，关于上述4种龟肉精深加工特别是酶解工艺的研究报道较少，限制了其商业价值和资源的高值化利用。本实验采用复合蛋白酶对石龟、草龟、花龟、鳄龟肉进行酶解，对比不同龟肉酶解产物中总氨基酸和游离氨基酸的组成和含量，对其进行营养评价并分析酶解产物的呈味特性，为4种龟肉的开发利用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄喉拟水龟、中华草龟、中华花龟、鳄龟：由四会市康源水产养殖场提供；胰蛋白酶(酶活4000 U/g)：重庆市全新祥盛生物制药有限公司；风味蛋白酶(酶活500 LAPU/g)：丹麦诺维信公司；氨基酸混合标准品：美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ME204E电子天平、FE20 pH计 梅特勒-托利多有限公司；JYS-A960绞肉机 九阳股份有限公司；BWS-12精密恒温水槽 上海一恒科学仪器有限公司；3K15台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；L8900全自动氨基酸分析仪 日本Hitachi公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理

将活龟去头放血，取可食用部位肉，用绞肉机绞碎混匀，在-18 ℃低温保存，备用。

1.3.2 酶解液制备

将冻藏龟肉置于室温溶解后，准确称取50 g，加入8倍蒸馏水，打浆后调pH至7.0，分别加入浆液总重量0.6%的胰蛋白酶和0.3%的风味蛋白酶，搅拌均匀后置于500 mL三角瓶中，在55 ℃水浴摇床中酶解3 h。酶解结束后，将盛有酶解液的三角瓶置于水浴锅中95 ℃灭酶20 min。将酶解液在室温冷却后，在 4 ℃条件下以8000 r/min离心10 min，取上清液即为龟肉酶解液，在-18 ℃冻存备用[11]。

1.3.3 氨基酸测定

总氨基酸和游离氨基酸的测定参考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》，采用全自动氨基酸分析仪测定16种氨基酸的含量。由于采用酸水解法处理样品，故未检测色氨酸含量。

1.4 数据分析

总氨基酸分析：分别统计总氨基酸(total amino acid，TAA)含量、必需氨基酸(essential amino acid，EAA)含量、非必需氨基酸(non-essential amino acid，NEAA)含量[12]。游离氨基酸分析：分别统计总游离氨基酸(total free amino acid，TFAA)和呈味氨基酸的含量。游离氨基酸呈味强度值(taste activity value，TAV)是指某游离氨基酸的含量与该游离氨基酸呈味阈值的比值[13]。所有测定均进行3次重复实验，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 4种龟肉酶解液总氨基酸分析

由表1可知，4种龟肉的酶解液中均检测到16种氨基酸，表明这4种龟肉中氨基酸的种类较丰富，但在总氨基酸含量上存在差异，4种龟肉酶解液总氨基酸含量大小依次为草龟>花龟>石龟>鳄龟，分别为23.577，23.004，22.936，21.849 mg/g。4种龟肉酶解液中含量最高的3种氨基酸排列规律相同，均为谷氨酸最高，其次为天冬氨酸和赖氨酸，含量最低的氨基酸均为蛋氨酸，与文献[2]和文献[3]一致，表明这几种氨基酸在部分龟鳖科动物中的分布可能具有一定规律性。草龟肉酶解液中谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸的含量均为4种龟肉酶解液中最高，最低均为鳄龟肉酶解液，这可能与4种龟肉酶解液的总氨基酸含量大小存在关联性。4种龟肉酶解液中均有12种氨基酸的含量>1.0 mg/g，且种类均相同；脯氨酸、组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸这4种氨基酸在4种龟肉酶解液中的含量均<1.0 mg/g。

表1 4种龟肉酶解液总氨基酸分析Table 1 The analysis of total amino acids of enzymatic hydrolysates of four kinds of Emydidae meat

续 表

龟肉酶解产物作为呈味基料，不仅要求其具有良好的风味感官，还需要有较好的营养价值。而营养价值主要取决于其所含的EAA种类和组成比例，EAA组成比例与人体所需氨基酸比例越接近，则其品质越佳。4种龟肉酶解液中均含有7种EAA，EAA总量大小依次为草龟(9.271 mg/g)>花龟(9.134 mg/g)>石龟(9.088 mg/g)>鳄龟(8.284 mg/g)肉酶解液，EAA/TAA分别为39.32%、39.71%、39.61%、37.91%，EAA/NEAA分别为64.81%、65.85%、65.62%、61.07%。根据FAO/WHO规定的EAA/TAA为40%、EAA/NEAA为60%的标准，花龟、草龟、石龟肉酶解液的EAA/TAA较接近40%，EAA/NEAA均>60%，表明这3种龟肉酶解液的营养价值较高。

2.2 4种龟肉酶解液游离氨基酸分析

游离氨基酸不仅大部分本身具有特殊滋味，而且可以通过脱羧、脱氨等作用生成其他挥发性风味物质，对食物的整体风味产生重要影响，还可作为Maillard反应的底物，为酶解产物制备热反应型肉味香精提供物质基础[14]。

表2 4种龟肉酶解液游离氨基酸分析Table 2 The analysis of free amino acids of enzymatic hydrolysates in four kinds of Emydidae meat

由表2可知，4种龟肉酶解液中均含有16种游离氨基酸。TFAA含量最高的是花龟肉酶解液(11.058 mg/g)，其次为草龟肉酶解液(10.449 mg/g)、石龟肉酶解液(10.087 mg/g)，最低为鳄龟肉酶解液(9.077 mg/g)。4种龟肉酶解液TFAA的大小排序与其TAA的顺序不完全一致，这可能是由于不同种类龟肉蛋白质结构存在差异，导致复合蛋白酶对其切割方式和效率不同。4种龟肉酶解液中含量和百分比最高的两种FAA均为赖氨酸、亮氨酸，这与两者在4种龟肉酶解液总氨基酸中的含量和百分比排序所处位置不一致，推测本实验所用的复合蛋白酶对这两种氨基酸的酶切位点有偏好性。草龟肉酶解液的赖氨酸含量最高(1.463 mg/g)，石龟肉酶解液的亮氨酸含量最高(1.349 mg/g)，而这两种氨基酸在TFAA中的百分比均以鳄龟肉酶解液最高。石龟、草龟、花龟、鳄龟肉酶解液的FAA分别有2，3，3，2种氨基酸含量>1.0 mg/g，与TAA中含量>1.0 mg/g的氨基酸均有12种，相比较少，说明酶解液中大部分的氨基酸以可溶性蛋白质或短肽形式存在。

4种龟肉酶解液中游离氨基酸的EAA/TFAA(58.06%～61.06%)、EAA/NEAA(138.43%～156.91%)明显大于其在总氨基酸中的对应值，均高于FAO/WHO的推荐值，与鲫鱼肉酶解液中的对应值相当，高于金枪鱼、斑点叉尾鮰鱼鱼头等水产品酶解产物中的对应值[15-16]。

2.3 酶解液呈味特性和TAV分析

游离氨基酸是肉类酶解液重要的呈味物质，大部分有着独特的滋味，呈现出甜味(Ala、Gly、His、Pro、Ser、Thr)、鲜味(Asp、Glu、Lys)以及苦味(Arg、Ile、Leu、Met、Val)，其绝对含量及相对比例会直接影响食物的鲜美程度，而一般认为芳香族氨基酸(Phe、Tyr)无味或呈味特征不明确。

图1 4种龟肉酶解液呈味氨基酸含量Fig.1 The content of flavor amino acids in enzymatic hydrolysates of four kinds of Emydidae meat

由图1可知，在呈味氨基酸总量上，花龟肉酶解液最高，其次为草龟肉酶解液、石龟肉酶解液，鳄龟肉酶解液最低。4种龟肉酶解液中呈味氨基酸各种类的组成比例相似，贡献较大的有苦味氨基酸和鲜味氨基酸，甜味氨基酸含量较少，芳香族氨基酸最少。苦味氨基酸含量最高的为花龟肉酶解液，其次为草龟肉酶解液，石龟、鳄龟肉酶解液较少；鲜味氨基酸含量以草龟、石龟肉酶解液较高；甜味氨基酸含量最高的是花龟肉酶解液，其他几个品种龟肉酶解液较为接近；对于芳香族氨基酸，石龟、草龟、花龟肉酶解液含量较相近，鳄龟肉酶解液略低。总体上，呈味氨基酸的种类与含量与龟肉味甘、咸平的风味特性较吻合，推测氨基酸与其风味存在一定内在联系。

由于各种呈味氨基酸的味觉感知阈值不同，因此，虽然不同氨基酸在4种龟肉酶解液中的含量存在差异，但含量高的氨基酸对酶解液风味的贡献不一定大，故利用TAV对4种龟肉酶解液中的各呈味氨基酸进行评价。当TAV<1时，表示该氨基酸对酶解液整体风味贡献不大，TAV越大，表示其对风味贡献越大。

表3 4种龟肉酶解液呈味氨基酸TAV分析Table 3 The TAV of flavor amino acids in enzymatic hydrolysates of four kinds of Emydidae meat

续 表

由表3可知，经过TAV变换后，在所有TAV>1的氨基酸中，除花龟肉酶解液的蛋氨酸外，4种龟肉酶解液中均有6种氨基酸TAV>1，且种类相同，分别为谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、缬氨酸、精氨酸和苯丙氨酸，表明这6种氨基酸对龟肉酶解液的风味有重要影响，但其对不同龟肉酶解液风味的贡献程度不一。总体上，苦味氨基酸和鲜味氨基酸对4种龟肉酶解液的呈味特性贡献较大。石龟、草龟肉酶解液中TAV最高的氨基酸是谷氨酸，其次分别为缬氨酸、精氨酸，谷氨酸在呈味氨基酸中的鲜味最强，是重要的鲜味剂，缬氨酸具有抑甜作用，精氨酸有提高鲜度和增加呈味复杂性的作用[17]。精氨酸是花龟肉酶解液中TAV最高的氨基酸，其次为谷氨酸。鳄龟肉酶解液中TAV最高的氨基酸是组氨酸，其次为谷氨酸，组氨酸是半必需氨基酸，有增加呈味复杂性和提升鲜度的作用，在火腿中含量较高。

3 结论

本实验采用复合蛋白酶对石龟、草龟、花龟和鳄龟肉进行酶解，利用氨基酸自动分析仪对4种龟肉酶解液中的总氨基酸和复合氨基酸进行对比分析。结果表明，4种龟肉酶解液的总氨基酸中均检测到16种氨基酸，均以谷氨酸最高、蛋氨酸最低，总含量最高的为草龟肉酶解液。花龟、草龟、石龟肉酶解液的EAA/TAA、EAA/NEAA与FAO/WHO标准较接近，表明这3种龟肉酶解液的营养价值较高。

4种龟肉酶解液的游离氨基酸中均含有16种氨基酸，总含量最高的是花龟肉酶解液，最低的是鳄龟肉酶解液；含量最高的游离氨基酸均为赖氨酸。4种龟肉酶解液游离氨基酸的EAA/TFAA、EAA/NEAA明显大于其总氨基酸中的对应值，高于部分水产品的酶解产物。呈味分析显示，呈味氨基酸总量上以花龟肉酶解液最高，鳄龟肉酶解液最低。4种龟肉酶解液呈味氨基酸种类的组成比例相似，均有种类相同的6种呈味氨基酸TAV>1，但其对不同龟肉酶解液风味的贡献作用有较大差异，苦味氨基酸和鲜味氨基酸对风味贡献较大。本实验为养殖龟可食用部位肉的酶解产物作为呈味基料的应用提供了理论依据，为龟肉深加工产品的开发方向提供了参考。