叶亚玲 王自蕊 游金明 邓宸玺 辛向荣

(江西农业大学江西省动物营养重点实验室，南昌 330045)

断奶时期是仔猪由被动免疫向主动免疫的过渡阶段，也是仔猪免疫功能的调节时期。3周龄左右断奶的仔猪，其免疫功能尚不完善，产生的主动免疫水平较低，抗病力较弱［1］。仔猪本身的免疫水平决定了机体的健康状况和药物使用情况，并间接影响着猪肉产品的质量与安全。因此，从源头上调节仔猪的免疫系统，提高仔猪的免疫力是解决上述问题的关键。研究表明，适量补充谷氨酰胺(glutamine，Gln)能有效提高仔猪的免疫力，缓解仔猪的断奶应激［2-5］。小肠是机体最大的免疫器官，小肠黏膜在仔猪局部免疫中发挥着重要的防御作用。Gln作为仔猪的一种条件性必需氨基酸［6］，可为小肠黏膜的细胞分化提供能量和氮源，进而促进受损肠黏膜的修复以及维持正常的局部免疫功能［7-9］。但由于断奶中断了仔猪获得母源性Gln，加上自身合成谷氨酰胺的能力有限，仔猪往往容易缺乏Gln。因此，外源性地添加Gln对缓解仔猪断奶应激，增强断奶仔猪免疫功能具有十分重要的意义。小肠黏膜固有层免疫球蛋白A(IgA)浆细胞数量、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)及黏膜中白细胞介素含量是反映仔猪免疫水平的重要指标。因此，本试验通过在断奶仔猪饲粮中添加不同水平的丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)，观察Ala-Gln对仔猪肠道黏膜固有层IgA浆细胞数量、SIgA及白细胞介素含量等黏膜免疫指标的影响，为指导Ala-Gln在仔猪饲粮中的科学利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用Ala-Gln购自上海超强化工有限公司，分子式为C8H15N3O4，相对分子质量为217.22，纯度≥99.0%。

1.2 动物分组

根据遗传背景和体重相近原则，选用100头(6.7±0.9)kg、(21±2)日龄断奶的长白×大白仔猪，按完全随机区组设计分为4个组，每组5个重复，每个重复5头仔猪。

1.3 饲粮设计与饲养管理

对照组仔猪饲喂玉米-豆粕型基础饲粮，其他各组分别饲喂在基础饲粮中添加0.15%、0.30%、0.45%Ala-Gln的试验饲粮。基础饲粮参考NRC(2012)和我国猪饲养标准(2004)推荐的猪营养需要进行配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。

试验在正邦集团某原种猪场进行。仔猪饲养于装有高床、漏缝地板、不锈钢可调式料槽、乳头式饮水器的保育舍。每日饲喂4次(07:30、11:30、15:30、19:30)，自由采食和饮水。其他饲养管理、免疫措施按猪场的常规程序执行。试验期为21 d。

1.4 样品采集与制备

于试验第7、14、21天早晨，从每个重复中选取1头接近平均体重的仔猪进行屠宰，打开胸腔，分别在十二指肠、空肠、回肠中段剪取3 cm肠段，用生理盐水小心冲去食糜，置于10%中性甲醛溶液中固定。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

另剪取15 cm空肠，轻轻挤去食糜，用4℃去离子水冲洗。纵向剪开肠壁，在表面皿中展开，滤纸吸水后用载玻片轻轻刮取肠黏膜，装于无菌冻存管内，立即放入液氮中速冻，然后转入-80℃超低温冰箱中冻存。准确称取1 g左右的黏膜，按1∶9质量体积比加入生理盐水，使用电动匀浆器将黏膜冰浴匀浆，制成悬浮液，然后置冷冻离心机中3 000×g离心10 min(4℃)。分离上清液，即为10%的黏膜匀浆液。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 小肠黏膜固有层IgA浆细胞数量

1.5.1.1 常规石蜡切片制作

将固定好的十二指肠、空肠、回肠组织块修整为适当大小，经常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、展片、贴片后，置于37℃的恒温箱内烤干，以备染色。

1.5.1.2 小肠 IgA 浆细胞数量

小肠IgA浆细胞数量采用二步聚合物免疫组化法进行检测。步骤如下:

①将烘干后的切片经二甲苯脱蜡，从高浓度酒精到低浓度酒精逐级复水(100%2次、95%、90%、80%、70%、60%)。之后再用蒸馏水洗 5～10 min。

② 将切片置于已加热至沸腾的0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH=6.0)中，保持沸水浴15 min以修复抗原。取出切片，冷却至室温，吸干。

③ 滴加3%H2O2去离子水，孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶活性。甩干切片，用磷酸盐(PBS)缓冲液冲洗3次，每次2 min。

④ 滴加一抗——羊抗猪SlgA抗体(bethyl laboratories)。使用时用抗体稀释液做适当的稀释，最终工作液浓度为1∶200)，切片放入湿盒中，37℃孵育3 h。阴性对照组用PBS代替一抗。PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min。

⑤ 滴加试剂1(polymer helper)，室温孵育10～20 min，PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min。

⑥ 滴加试剂2(poly-HRP anti-goat IgG)，室温孵育 10～20 min，PBS缓冲液冲洗 3次，每次3 min。

⑦应用二氨基联苯胺(DAB)溶液避光显色10 min。

⑧自来水充分冲洗，终止显色。

⑨ 苏木紫复染1 min，自来水冲洗10 min。醇酸分色30 s，自来水洗净，PBS冲洗10 min。

⑩ 酒精梯度脱水，二甲苯透明8 min，封片。

采用江南BM2000光学显微镜观察，在相同放大倍数下随机选择10个视野拍照。Image Pro Plus 6.0软件计数浆细胞数量，计算平均值。

1.5.2 小肠黏膜SIgA 含量

取10%的黏膜匀浆液，利用SIgA酶联免疫试剂盒(上海博古生物科技有限公司)采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定小肠黏膜中SIgA的含量。向预先包被了猪SIgA单克隆抗体的酶标孔中加入目的蛋白，温育。加入生物素标记的抗SIgA抗体，再与链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成免疫复合体，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物工作液显色，最后加入终止液终止反应。用酶标仪在450 nm波长下测定样品孔和标准孔的吸光度(OD)值，通过标准曲线计算出对应样品中SIgA含量。

1.5.3 小肠黏膜白细胞介素含量

取10%的黏膜匀浆液，采用125I放射免疫试剂盒测定小肠黏膜中的白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素 5(interleukin-5，IL-5)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)含量。试剂盒均购自上海博古生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 数据处理与统计分析

所有试验数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，F检验组间差异显著者再进行Duncan氏法多重比较，以分析不同水平的Ala-Gln对断奶仔猪小肠黏膜固有层IgA浆细胞数量、SIgA及黏膜中白细胞介素含量的影响。P＜0.05为差异显著判断标准，P＜0.01为差异极显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 Ala-Gln对断奶仔猪小肠固有层IgA浆细胞数量的影响

表2数据显示，与对照组相比，饲粮添加0.15%～0.45%Ala-Gln 能够显著增加仔猪断奶后第7、14、21天十二指肠以及空肠中固有层IgA浆细胞数量(P＜0.05)，尤其是 0.30%Ala-Gln 组仔猪在断奶第14天空肠IgA浆细胞数量比对照组显著增加了 22.6%(P＜0.05)。在回肠中，0.30%Ala-Gln组显著提高了仔猪断奶后第7、14天IgA浆细胞数量(P＜0.05)，而其他组与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。

表2 Ala-Gln对断奶仔猪小肠固有层IgA浆细胞数量的影响Table 2 Effects of Ala-Gln on the numuber of SIgA plasma cells in gut lamina propria of weaner piglets

2.2 Ala-Gln对断奶仔猪空肠黏膜SIgA含量的影响

表3数据显示，仔猪断奶后第7天，空肠黏膜中SIgA的含量随Ala-Gln添加量的增加呈现明显的二次曲线变化规律(P=0.000，R2=0.962)。其中，0.30%Ala-Gln 组 SIgA 含量达 0.167 g/L，比对照组提高 70.4%(P＜0.01)，而 0.15%、0.45%Ala-Gln组与对照组之间差异不显著(P＞0.05)。仔猪断奶后第14天，空肠黏膜SIgA含量变化规律也呈二次曲线变化规律(P=0.001，R2=0.913)，其中 0.15%、0.30%Ala-Gln组与对照组相比分别提高了 34.9%、64.1%(P＜0.05)，但 0.45%Ala-Gln组SIgA含量与对照组差异不显著(P＞0.05)。仔猪断奶后第21天，空肠黏膜SIgA含量变化与第14天相似。

表3 Ala-Gln对断奶仔猪空肠黏膜SIgA含量的影响Table 3 Effects of Ala-Gln on concentration of SIgA in jejunum mucous of weaner piglets

2.3 Ala-Gln对断奶仔猪小肠黏膜白细胞介素含量的影响

表4数据显示，饲粮中添加Ala-Gln能够提高仔猪断奶后小肠黏膜白细胞介素的含量，有助于仔猪的肠道健康。与对照组相比，在断奶后第7天，0.15% ～0.30%Ala-Gln 组能够显著提高仔猪小肠黏膜中 IL-2、IL-5、IL-6、IL-10 含量(P＜0.05);IL-2、IL-5含量随着 Ala-Gln的添加量呈现先升高后降低的二次曲线变化规律，而IL-6、IL-10含量则呈线性升高变化。与对照组相比，在断奶后第 14天，0.15%Ala-Gln组均使 IL-2、IL-5含量得到显著提高(P＜0.05);各 Ala-Gln组均显著提高 IL-6、IL-10 含量(P＜0.05)。与对照组相比，在断奶后第21天，各Ala-Gln组均显著提高IL-2、IL-6、IL-10含量，而对IL-5含量无显著影响(P＞0.05)。

3 讨论

3.1 Ala-Gln对断奶仔猪小肠固有层 IgA浆细胞数量及SIgA含量的影响

给早期断奶仔猪补充适量的Ala-Gln能有效防止断奶应激并提高其生产性能。席鹏彬等［10］研究表明，饲粮中添加0.125%和0.250%Ala-Gln可显著降低“杜×大×长”断奶仔猪的料重比，并提高饲料利用率。黄冠庆等［11］在给21日龄断奶仔猪饲粮中添加 0.10%、0.30%Ala-Gln 后发现，仔猪的平均日增重和饲料转化率显著提高。本研究小组在前期的研究中也获得了相似的结果，即饲料中添加0.30%Ala-Gln后，21～35日龄仔猪日增重显著提高，当Ala-Gln添加量由0.15%提高到0.45%时，21～28日龄、29～35日龄、36～42日龄仔猪的腹泻率和腹泻指数呈线性降低趋势［12］。Ala-Gln对断奶仔猪的促生长作用源于其对仔猪小肠的保护作用。小肠被认为是动物体内最大的免疫器官，肠黏膜在小肠局部免疫中发挥着重要的防御功能。小肠黏膜固有层是机体肠道发挥免疫应答的主要场所，而SIgA是免疫应答的重要效应分子。当机体感受来自抗原的刺激时，将分泌大量的IgA。SIgA通过特殊的空间构象或与黏液混合阻断病原体粘附在黏膜表层，从而发挥其免疫防御作用［13］。

表4 Ala-Gln对断奶仔猪小肠黏膜白细胞介素含量的影响Table 4 Effects of Ala-Gln on the content of interleukin in gut lamina propria of weaner pigs pg/mL

Gln是小肠代谢的主要供能物质［7］。早期断奶仔猪通过饲粮摄入的Gln很少，加之自身合成不足，肠黏膜结构损伤，免疫细胞的增殖下降，这在很多研究中都得到了证实［14-16］。本试验研究发现，Ala-Gln能够缓解因断奶应激造成的小肠SlgA浆细胞分布的减少。添加0.15%～0.45%Ala-Gln均显著提高仔猪断奶后第7、14、21天十二指肠以及空肠黏膜固有层IgA浆细胞数量。同时，仔猪空肠黏膜SIgA含量随着Ala-Gln添加量的增加呈二次曲线增长规律。

Ala-Gln可能是因向肠黏膜固有层免疫细胞提供能量来源和代谢前体，进而影响浆细胞的数量分布及SIgA的分泌量。研究表明，适量的Ala-Gln在全胃肠外营养(TPN)中可增加大鼠小肠黏膜上皮细胞的DNA含量，促进肠上皮细胞的复制和分裂［17-18］。对于断奶仔猪，则可以提高肠上皮细胞和肠系淋巴细胞的增殖［19］。由于SIgA是由浆细胞合成分泌，浆细胞数量的变化必然会影响SIgA的分泌量，进而影响机体对外来抗原的抵抗力。

本试验同时表明，仔猪肠黏膜SIgA含量随Ala-Gln添加量的增加呈先升后降二次曲线变化规律。当Ala-Gln添加量达到0.45%时，SIgA含量恢复到与对照组一样的水平。出现这一结果，可能是由于过高剂量的Ala-Gln进入机体后大量水解成氨基酸单体的缘故。周玉香等［20］研究发现，颈静脉灌注中等水平Ala-Gln(每千克体重0.68 g/d)，连续灌注7 d，可有效提高早期断奶犊牛骨骼肌蛋白质的水平、空肠黏膜DNA含量及骨骼肌和空肠黏膜RNA含量。但对Gln需要量有一定的限度，过量补充只能造成Gln的分解代谢。当然，本研究结果也可能与仔猪获得了免疫耐受有关。

3.2 Ala-Gln对断奶仔猪小肠黏膜中白细胞介素含量的影响

白细胞介素作为免疫系统中的重要信息分子，在免疫调节中扮演着十分关键的角色。抗原特异性B细胞迁移成熟分化为IgA浆细胞，产生SIgA，这一过程需要白细胞介素的参与。IL-2是活化T淋巴细胞产生的一种多肽类免疫调节因子，可促进T、B淋巴细胞的增殖分化和特异性抗体的产生，并最终促进IgA介导的有效免疫应答及 SIgA 的有效增加［21］。IL-5、IL-6及 IL-10 可以增强IgA的分泌，促进IgA定向性B细胞的分裂，对浆细胞在黏膜效应位点的定位、终末分化、增生及增强IgA的反应起关键作用［22-24］。大量研究表明，早期断奶应激易引起仔猪体液免疫和细胞免疫水平下降，并导致肠道炎症反应。肠上皮细胞产生的多种白细胞介素(如 IL-1、IL-2、IL-6、IL-10)参与了肠道的炎症反应［25］。而且肠黏膜固有层T淋巴细胞及其合成分泌的IL-2、IL-5、IL-6等构成了固有层IgA阳性及细胞微环境［26］。应激使得仔猪肠上皮细胞促炎因子IL-1含量增加，而抗炎因子 IL-10 快速下降［27］。Fukatsu 等［28］和Yassad-Wozniak等［29］在 TPN中给予谷氨酰胺后发现，肠道相关淋巴组织细胞因子维持正常水平，因传统TPN减少的小肠IgA及小肠匀浆上清液中辅助性T细胞Th2、IL-10含量显著提高。俞开敏［30］在IL-5及嗜酸性粒细胞对人肠黏膜损伤的研究也发现，IL-5可延长嗜酸性粒细胞存活时间，促进对牙囊原虫的免疫应答，当原虫刺激人体时，IL-5会迅速合成并作出应答。刘涛［31］研究表明，仔猪断奶后第5天，小肠黏膜IL-6基因表达量显著下降，断奶后第11天恢复到断奶前水平。本试验结果显示，饲粮中添加 0.15%、0.30%Ala-Gln后，仔猪断奶第7、14天 IL-2、IL-5的含量获得显著提高。Ala-Gln同时还显著提高了各组仔猪IL-6、IL-10的含量。这一结果表明，Gln可通过影响炎症因子和白细胞介素，调节机体免疫功能。

4 结论

饲粮中添加Ala-Gln可提高断奶仔猪断奶后小肠黏膜固有层IgA浆细胞数量和SIgA的分泌量，在一定程度上提高肠黏膜白细胞介素的含量，增强机体免疫应答，提高断奶仔猪肠道黏膜免疫。

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