袁　超，赵　彤，敖育健，程　环

生物显微镜数字图像白平衡的影响因素研究

袁超，赵彤，敖育健，程环

目的：研究生物显微镜数字图像白平衡的影响因素及如何调整获得最佳结果。方法：用色温仪分别测量各因素作用时的数据及其之间的相互影响，用SASS软件进行统计学分析。结果：物镜的使用可以增加色温200～300 K，使用LBD滤色片可增加色温值400～1 800 K，减小视场光阑90%可降低色温约400 K，ND6滤光片、ND25滤光片、孔径光阑对色温无影响。结论：生物显微镜中各电学、光学元器件的参数要经过科学的调整才能获得数字图像正确的白平衡。

显微镜数字图像；白平衡；色温；LBD滤色片；ND6/ND25滤光片

0　引言

影响显微镜数字图像质量的因素很多，如分辨率、清晰度、白平衡、对比度、像素、噪声、动态范围等[1]。白平衡也可以称为色温，色温是表示光源光谱质量最通用的指标，可以通俗地认为是表示光的颜色冷暖的物理参数。开尔文认为，假定某一纯黑物体，能够将落在其上的所有热量吸收而没有损失，同时又能够将热量生成的能量全部以“光”的形式释放出来，它产生辐射最大强度的波长随温度变化而变化[2]。人眼对色温是不敏感的，而电荷耦合器件（charge coupled device，CCD）则可真实记录色温，因此显微镜在数字成像时准确控制色温非常重要。影响显微镜图像色温的因素有卤素灯泡电压、视场光阑、孔径光阑、LBD滤色片、ND6滤光片、ND25滤光片等。本文主要研究各种因素对色温的影响以及怎样组合才能获得最准确的色温（5 500 K）。

1　材料与方法

1.1设备

Olympus BX53正置显微镜，配置12 V、100 W卤素灯泡，电压0～12 V可调，配备有视场光阑、孔径光阑、LBD滤色片、ND6和ND25滤光片、DP72制冷CCD、CELLSENCE图像分析软件及计算机硬件；柯尼卡美能达CL-500A色温仪。

1.2标本制备步骤

活体组织病理切片—石蜡包埋—苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.3测试方法与步骤

1.3.1验证不同物镜对色温的影响

方法：取出目镜观察筒中的目镜，将色温仪对准观察筒，使二者间没有孔隙（如图1所示）。选择一个物镜，点亮卤素灯泡，先后选择1～12 V整数位共计12个电压值，用色温仪测量记录不同电压时的读数，测量3次取其平均值记录，然后更换不同物镜，重复以上步骤。

图1　验证不同物镜对色温的影响

2　结果与分析

2.1不同物镜对色温的影响

实验测得的数据见表1，编写并运行SASS程序，得到统计学分析结果见表2。结果显示，用和不用物镜结果有统计学差异，100×物镜与其他物镜结果有统计学差异。但在实际测量中，光透过100×物镜后变得很弱，色温仪测量时间显著延长，从而使测量结果出现一定程度的偏差。除100×物镜外，光经过物镜后色温增加约200～300 K（如图3所示），图中系列1～6分别为无物镜、4×物镜、10×物镜、20×物镜、40×物镜、100×物镜时测得的色温值随电压变化曲线。

表1　不同物镜下实验测得的色温值

表2　物镜对色温的影响结果

图3　不同物镜对色温的影响曲线

2.2电学、光学元器件对色温的影响

测得的数据制成表3，编写并运行SASS程序，得到统计学分析结果见表4。结果显示，用和不用LBD滤色片结果有统计学差异；视场光阑减少90%与各组结果有统计学差异；孔径光阑、ND6滤光片、ND25滤光片对结果无统计学影响。只使用卤素灯泡、不使用光学元器件时，色温较低。电压越低、色温越低，电压越高、色温越高。LBD滤色片的使用对色温值的改变具有显著影响，使用该滤色片可大大增加色温值，增加量为400～1 800 K。减小视场光阑90%对色温有影响，可降低色温约400 K。ND6滤光片、ND25滤光片、孔径光阑对色温无影响（如图4所示）。图中系列1～6分别为无滤色片和光阑、单LBD滤色片、90%单孔径光阑、90%单视场光阑、单ND6滤光片以及单ND25滤光片时的色温值随电压变化的曲线。

表3　不同电学、光学元器件下实验测得的色温值K

表4　电学、光学元器件对色温的影响结果

图4　电学、光学元器件对色温的影响曲线

3　讨论

色温对显微镜的图像质量有重要影响，主要表现在光源的色温会影响到图像色彩的还原[3]。在生物医学中，通过多种染色技术使不同细胞、组织或细胞的不同成分具有不同的颜色，借此加以区分。如果色温不准确，就会使本来红色的细胞质显示为紫色，本来蓝色的细胞核显示为黑色[4]。日常生活中，比如在路灯下面，衣服或者其他物体的颜色会显得很不一样，这就是光源色温影响了大脑对于物体颜色的判断，对于显微镜的CCD也会有同样的问题。人眼对颜色有自我适应的功能，这使我们不管是在日光、荧光灯、钨丝灯下看到的白色物体仍然是白色，只有在一些比较极端的情况下才会有偏差，而显微镜CCD的传感器与此不同，会显示物体的真实颜色色温。调整白平衡的过程称为白平衡调整，白平衡调整的基本原理是对于低色温的光源，其中的红光占比例较高，我们就可以降低红光的比例，提高蓝光的比例，从而使各种颜色达到平衡，让白色呈现出本来的白色。对于高色温的光源也是类似，通过降低蓝光比例，提高红光比例来达到调整白平衡的目的[5]。

LBD滤色片也叫做白平衡滤色片[6]，其作用类似于蓝色滤色片，可以将光路中一部分黄光滤掉，在灯泡电压较低、光偏黄时作用有限，只有与适当电压相配合时才能将光滤成接近白色。ND滤光片也被称为中灰滤光片，其作用是降低光的强度而不改变光的颜色，ND6滤光片的作用是滤掉94%的光量而剩下6%的光强[7]。

通过对以上实验因素的分析总结得到数字图像色温偏低、图像偏黄的原因有：未使用LBD滤色片；使用LBD滤色片、低倍镜时未使用ND6/ND25滤光片，为使图像不过亮过曝，灯泡电压远不到12 V；使用LBD滤色片、低倍镜时未使用ND6/ND25滤光片，为使图像不过亮、过曝，严重缩小视场光阑。数字图像色温偏高、图像偏黄蓝的原因有：未使用LBD滤色片，为克服图像偏黄，加了蓝色滤色片；使用LBD滤色片，设置正确后又加了蓝色滤色片；使用LBD滤色片、低倍镜时，灯泡电压给的太低，图像偏黄，后加了蓝色滤色片；使用LBD滤色片、低倍镜时，严重缩小视场光阑图像偏黄，后加了蓝色滤光片。

综合分析，为得到最准确的白平衡和最佳图像质量，技术流程为：（1）将灯泡电压置于12 V固定不变；（2）将LBD滤色片放置于光路中；（3）将视场光阑全部打开；（4）选择合适物镜；（5）调整孔径光阑，使其数值=物镜数值孔径（NA）值×80%[8]；（6）根据物镜倍数大小，选择ND滤光片组合：4×物镜时选择ND6+ND25滤光片；10×物镜时选择ND6滤光片；20×物镜、40×物镜时选择ND25滤光片；100×物镜时全不选。

[1]袁超，程环.显微镜数字图像的质量控制[J].医疗卫生装备，2012，33（10）:100-103，120.

[2]叶永沛.色温滤色片的设置与白平衡的校正运用技术[J].电视制作，2014（3）:52-53.

[3]张数霖.近场光学显微镜及其应用[M].北京:科学出版社，2000.

[4]宋菲君.近代光学信息处理[M].北京:北京大学出版社，1998.

[5]高宝昌.数码相机的色温和白平衡[J].照相机，2013（7）:29-33.

[6]李文忠.日本Olympus显微镜用的滤色片[J].北京生物医学工程，1986（2）:57-59.

[7]纪孝阳.光电器件生产中光源色温正确标定的重要性[J].红外技术，1984（5）:26-36.

[8]郭嘉泰.影响显微镜分辨率的几种因素[J].中国医学物理学杂志，2013，20（4）:278-279.

（收稿：2014-05-16修回：2014-09-09）

（栏目责任编校:李影）

Factors affecting digital image white balance of biological microscope

YUAN Chao1,ZHAO Tong2,AO Yu-jian3,CHENG Huan1
(1.Experimental Instrument Plant,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China; 2.Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China; 3.Beijing Lead-color Technology Development Co.,Ltd.,Beijing 100390,China)

Objective To study the influencing factors of digital image white balance of the biological microscope and the way to obtain optimized image.Methods Color temperature meter was used to measure the influences of the factors and their correlations,and SASS software was employed for statistical analysis.Results Object lens might increase the color temperature by 200 to 300 K,LBD color filter could enhance it by 400 to 1 800 K.Reducing field stop by 90%might decrease color temperature by 400 K.ND6 filter,ND25 filter and aperture diaphragm had no influences on color temperature.Conclusion The electric and optical parameters of biological microscope have to be adjusted to gain proper white balance for digital image.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（5）：95-97]

microscope digital image;white balance;color temperature;LBD color filter;ND6/ND25 filter

[中国图书资料分类号]R318.6；TH773A

1003-8868（2015）05-0095-03

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.05.095

袁超（1979—），男，工程师，主要从事医学实验仪器计量、维修等方面的研究工作，E-mail:7book@163.com。

100850北京，军事医学科学院实验仪器厂（袁超，程环）；100850北京，军事医学科学院基础医学研究所（赵彤）；100390北京，北京利凯乐科技发展有限公司（敖育健）

1.3.2验证各光学元器件对色温的影响

方法：将色温仪的测光口对准显微镜聚光镜的出光口，由于二者大小契合，可以不做密闭连接装置（如图2所示）。分别选择什么都不使用，使用LBD滤色片、视场光阑、孔径光阑、ND6滤光片、ND25滤光片，测试在1～12 V共计12个整数电压值下色温仪的读数，测量3次取其平均值记录。

图2验证各光学元器件对色温的影响