王丽然 李书国

（河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018）

聚L－天冬氨酸／多壁碳纳米管修饰电极法快速测定麦麸中的酚酸

王丽然 李书国

（河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 050018）

研究了电聚合法结合吸附法制备聚L－天冬氨酸／多壁碳纳米管修饰电极及其对酚酸类物质的电化学催化作用及机理，建立了一种快速测定小麦麸皮中酚酸的新方法。在pH 3.0的磷酸氢二钠－柠檬酸溶液组成的电解质溶液中，该纳米修饰电极对没食子酸氧化有显著的电催化作用，没食子酸在电极上的氧化动力学过程为吸附控制过程；没食子酸在该纳米修饰电极上的氧化电流与其浓度在2×10－6～5.6×10－5mol／L范围具有良好的线性关系，最低检测限为7.6×10－7mol／L。利用该法测定了小麦麸皮中酚酸含量，其结果为（1 130.8±4.50）μg／g，与 Folin－Ciocalteu比色法的测定结果（1 180.7±8.18）μg／g一致，且具有简便、快速、灵敏的优点，所需化学试剂较少。

酚酸 纳米修饰电极 麦麸 快速测定

酚类化合物苯环上的羟基极易失去氢电子，故酚类化合物作为良好的电子供应体而发挥抗氧化功能［1－2］。酚酸是酚类物质中的一类，多为肉桂酸和苯甲酸的羟化衍生物［3］。前者通常与奎尼酸或葡萄糖酯化存在于食物中，主要有肉桂酸、咖啡酸和阿魏酸［4］。后者主要以配糖物的形式存在于食物中，最常见的有羟基苯甲酸、香草酸和没食子酸［5］。存在于植物源食品中的酚酸占总酚酸的1／3，而小麦麸皮是植物酚酸的重要资源。我国每年小麦麸皮产量在2 000万t以上，目前其主要用于添加到饲料中，经济利用价值极低［6］。根据存在的形式，麸皮中的酚酸可分为可溶性和束缚型2种。而大多数的酚酸是以后者的形式存在［3］。近年来，酚酸作为抵抗癌症和心脏病的潜在保护因子，受到越来越多的关注，其价值急剧提高。美国膳食营养学家也提倡全谷物食品的摄入量应达到每天3次，每次约100 g［2］。因此通过饮食摄入一定水平的酚酸对人体健康是有益的，而不同的谷物所含酚酸的种类和含量不同，快速测定谷物中酚酸的含量对指导科学饮食具有重要意义。

目前酚酸的分析测定方法有高效液相色谱法［7］、福林酚法［8］和毛细管电泳法［9］等。国内关于小麦麸皮中束缚型酚酸的电化学检测的报道很少。本试验研究了poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极的制备及其对酚酸的电催化作用，建立了一种谷物中酚酸的快速检测新方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

L－天冬氨酸：天津市科密欧化学试剂有限公司；多壁碳纳米管（MultiWalled Carbon Nanotubes，MWCNTs，8－15 nm，50μm，＞95%：北京德科岛金；麸皮（石优17号小麦）：河北黑马粮油工业有限公司提供。

1.2 仪器与设备

LK98BⅡ型微机电化学分析系统：天津兰力科化学电子高技术有限公司；三电极系统（3 mm玻碳圆盘电极为工作电极、铂丝电极为对电极、Ag／AgCl电极为参比电极）、电解杯：上海CHI仪器公司。

1.3 修饰电极的制备

1.3.1 电极的预处理

玻碳电极在使用前依次用1.0、0.3、0.05μm Al2O3粉抛光成镜面，用超纯水冲洗，再分别用 HNO3∶H2O＝1∶1（V／V）、乙醇、超纯水各超声清洗 30 s，除去表面吸附物；然后置于0.5 mol／L硫酸溶液中用循环伏安法扫描约10 min，扫描速度为50 mV／s，电压范围为－1.0～1.0 V，得到稳定的循环伏安图后，取出，用超纯水洗净，用氮气干燥后备用。

1.3.2 修饰电极的制备

准确称取0.1 g未纯化的MWCNTs于30 mL浓硝酸中，在磁力搅拌器下搅拌7 h后，再超声振荡分散2 h后，用超纯水洗至中性，置于烘箱中烘干，待用。称取0.01 g酸化后的MWCNTs样品，加入到10 mLN，N－二甲基甲酰胺中，然后超声分散30 min，形成1.0 g／L黑色悬浊液（此溶液至少可稳定30 d）。

称取一定量L－天冬氨酸置于磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液（pH＝6.0）中配制 2.0×10－3mol／L的L－天冬氨酸溶液。以预处理后的玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag／AgCl电极为参比电极放入该溶液中，在 －1.20～1.60 V（vs.Ag／AgCl）之间以100 mV／s的扫速循环扫描15圈，取出，超纯水冲洗，再用微量移液器取5μL上述MWCNTs分散液滴加在已修饰聚合物膜的电极表面，室温下干燥，即制得 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极。

1.4 麦麸中酚酸的检测

1.4.1 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极法测定酚酸

将制备好的电极置于5 mL pH 3的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液中，用循环伏安法研究了GA在不同条件下在修饰电极上的电化学行为（在0.0～0.8 V区间以50 mV／s循环扫描至稳定的循环伏安曲线）；用微分脉冲伏安法研究了GA氧化峰电流与其浓度的线性关系及检出限（设定初始电位0.0 V，终止电位1.0 V，电位增量0.001 V，脉冲幅度0.05 V，脉冲宽度0.05 s，脉冲间隔0.3 s，等待时间 5 s）；以标准曲线法测定了小麦麸皮中束缚型酚酸的含量（根据标准曲线计算酚酸的GA当量）。每次扫描后，将电极置于 pH＝3的磷酸氢二钠－柠檬酸空白溶液中循环扫描至无峰出现，消除吸附在电极表面的酚酸，电极即可复用。

1.4.2 Folin－Ciocalteu比色法

谷物中的酚酸是一类混合物，酚酸在不同定量分析方法上存在着一定的区别，已报道的有关酚酸的测定大多数是采用 Folin－Ciocalteu比色法［10］。本试验采用Folin－Ciocalteu比色法测定谷物中束缚型酚酸的总含量。

Folin－Ciocalteu试剂的配制：称取100 g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）和25 g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O），将两者溶解于700 mL水中，倒入2 L的圆底烧瓶中，加入50 mL 85%磷酸和100 mL浓盐酸，放入几粒玻璃珠，给烧瓶上连续回流冷凝器，用文火回流10 h（可不连续）。回流后用50 mL蒸馏水冲洗冷凝管上的附着物，然后取下。加150 g硫酸锂（LiSO4·2H2O）和几滴溴水（边加边摇）至金黄色，加热沸腾15 min，去除残余溴，用水稀释至1 000 mL，过滤，滤液成微绿色，置于棕色瓶中在冰箱中冷藏保存备用。

精确吸取0.5 mL待测溶液于比色管中，再分别吸取0.8 mol／L的 Folin－Ciocalteu试剂 0.75 mL，10%（质量分数）的Na2CO3溶液1.5 mL，蒸馏水定容至10 mL，在35℃温度下水浴一定时间后测定其在740 nm吸收波长下的吸光度。根据标准曲线测定束缚型酚酸的GA当量。

1.5 检测样品的处理

面粉加工副产物－小麦麸皮样品经粉碎后，取粒径直径为250～380μm之间的部分，以料液比为1∶20（m／V）正己烷脱脂，磁力搅拌 1 h，抽滤后残渣室温下阴干。取0.5 g脱脂麸皮，用40 mL的2 mol／L的NaOH溶液碱解18 h，于室温条件下5 000 r／min离心10 min，上清液调pH 3。残渣用40 mL的6 mol／L的 HCl溶液于沸水中酸解 1 h，冷却至室温5 000 r／min离心10 min，上清液调 pH 3。合并2次所得上清液中室温下避光保存待测。

2 结果与讨论

2.1 GA在 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE的电化学行为

利用循环伏安法分别记录了2.4×10－4mol／L的GA在裸玻碳电极，poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极上的伏安图，如图1所示。由图1可见，裸玻碳电极在空白溶液（a）中无峰出现，而在加入GA的溶液（b）中有一个小的氧化峰，说明GA在电极的表面被氧化。GA的电化学氧化方程：

如图1（c），poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极能够使GA的氧化峰电流增大，峰形改善且氧化峰电位正移至0.475 V。这归因于电极表面电聚合L－天冬氨酸产生的阳离子自由基和MWCNTs。玻碳电极上的C原子与自由基中的N共价结合，形成稳定的聚合膜。而聚合膜中含有大量的羧基，它与GA中羟基形成氢键。而MWCNTs具有大的比表面积和强的吸附能力，对GA有良好的吸附作用，从而提高氧化峰的电流。需要指出的是，GA在poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极上的背景电流显著增大，是MWCNTs修饰电极在修饰过程中所用的分散剂N，N－二甲基甲酰胺在电极表面覆盖所致。

图1 GA在不同电极上的循环伏安图

2.2 扫描速度对GA伏安行为的影响

图2是在浓度为8.0×10－5mol／L的 GA溶液中，利用循环伏安法研究了扫描速度在10～130 mV／s范围内（由内向外，扫速增大）对GA伏安行为的影响，随扫描速度的增大，GA的氧化峰电流逐渐增大，氧化峰电位逐渐正移。氧化峰电流（Ipa）与扫描速率（v）呈良好的线性关系，回归方程是Ipa＝0.015 7v＋1.883 3（Ipa单位为 μA，v单位为mV／s），R2＝0.995 4。这说明，GA在此复合膜内的氧化动力学过程为吸附控制过程。这也证明了，随扫描次数的不断增加，峰电流逐渐降低，最终趋于稳定的现象。

图2 不同扫描速度下GA在poly－L－Asp／MWCNTs／GCE电极上的循环伏安图

2.3 检测条件的优化

2.3.1 不同修饰材料对GA氧化峰电流的影响

王晓岗等［11－12］利用L－天冬氨酸修饰电极来检测茶多酚、阿魏酸等和许红岩等［13］利用Nafion／单壁碳纳米管／聚（3－甲基噻吩）修饰电极来检测绿茶饮料中的GA。本研究利用L－天冬氨酸在电极表面形成含有大量羧基且稳定的聚合物膜，并修饰比表面积大和吸附能力较强的MWCNTs，制备了响应灵敏的poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极，如图3所示。由图3中可以看出GA在poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极的氧化峰电流明显大于其他2个修饰电极，这证明MWCNTs可以加强电聚合物与电极表面的电子传递从而提高修饰电极的电流响应的灵敏度。

图3 4.2×10－4 mol／L GA在不同修饰电极的循环伏安图

2.3.2 电解质溶液的选择和溶液pH值的影响

GA在碱性条件下易被氧化，会影响检测结果的准确性和稳定性，所以本试验选择的支持电解质溶液为酸性范围中的缓冲溶液。如图4，在不同的电解质溶液中，研究了它们对1.5×10－4mol／L的GA的电化学行为的影响。

图4 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE电极在不同电解质溶液中的循环伏安图

结果表明，GA在不同缓冲液介质中，其电化学行为类似，仅是峰位置和峰电流不同而已。在0.2 mol／L磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液中GA峰电流最大且峰形良好。故选择0.2 mol／L磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液作为电解质溶液。

图5为8.0×10－5mol／L的GA在不同pH磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液的微分脉冲图。峰电流在pH 3.0时达到最高值，当pH 7.0后，氧化峰消失。GA的氧化峰电位随溶液pH值的增大而不断负移，表明GA的电化学过程伴随着质子的参与。GA的氧化峰电位（Epa）与支持电解质pH在2.0～5.0之间呈良好线性关系（如图6），其线性回归方程为：Epa＝0.664 5－0.08pH（Epa单位为 V），R2＝0.991 9，由于斜率 d（Epa）／d（pH）＝0.08可知，GA在电化学过程中的电子转移数与质子数相同。综上所述，试验中选择pH 3.0，0.2 mol／L磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液作为电解质溶液。

图5 GA在不同pH值条件下的微分伏安图

图6 pH值与峰电流和峰电位的关系

2.3.3 聚合物膜厚度和MWCNTs用量对GA氧化峰电流的影响

研究了1.5×10－4mol／L的GA的氧化峰电流与L－天冬氨酸修饰圈数的关系，如图7所示，随着修饰圈数增加，修饰电极在GA溶液中的峰电流增大，但当循环扫描到达15圈时，氧化峰电流达到最大值，当超过15圈后，峰电流有所下降。这可能是因为聚合膜太厚，阻止电子的传递。故选择L－天冬氨酸修饰圈数为15圈。

图7 L－天冬氨酸修饰圈数对峰电流的影响

如图8所示，在选择最优修饰圈数后，对MWCNTs最佳用量进行了研究所示，氧化峰电流开始随MWCNTs用量的增加而显著增加，这是因为电极表面富集活性位增多，对GA表现出高的富集效率，导致氧化峰电流增加。当超过5μL后，氧化峰电流逐渐降低，这是因为此时电极表面的MWCNTs量太多，阻碍了电子交换。故本试验中MWCNTs的用量为5μL。

图8 MWCNTs的用量对2.4×10－4 mol／LGA峰电流的影响

2.3.4 电参数的选择

微分脉冲伏安法能有效降低背景电流，具有简单快速、灵敏度高、选择性强和分辨率高等优点，因此选择此方法对GA进行检测分析。试验表明，设定的电参数为初始电位0.0 V，终止电位1.0 V，电位增量0.001 V，脉冲幅度0.05 V，脉冲宽度0.05 s，脉冲间隔0.3 s，等待时间5 s，此时GA有较好的峰型且峰电流大。

2.4 修饰电极的抗干扰能力

在pH 3.0磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液中，固定GA的浓度为2×10－5mol／L。考察了一些常见的离子和有机化合物对GA测定的干扰。试验表明50倍的NO3－对测定结果没有影响；5倍的葡萄糖、山梨酸、苯甲酸、苯酚、抗坏血酸、VE，对响应信号没有影响，氧化峰电位基本不变，显示出良好的抗干扰能力。因此该修饰电极可以用于实际样品中束缚型酚酸的测定。

2.5 标准曲线与检出限

图9给出GA在修饰电极上的微分脉冲伏安响应曲线，由图9可知，峰电流（Ipa）随GA浓度的增加而增加，并在2×10－6～5.6×10－5mol／L范围内，GA浓度与Ipa呈现良好的线性关系，线性方程为Ipa＝0.136 4＋0.015C（Ipa单位为 μA，C单位为 μmol／L），相关系数为R2＝0.993 4，最低检出限为7.6×10－7mol／L（信噪比为 S／N＝3），其灵敏度为0.015μA／（μmol／L）。

图9 不同浓度的GA在修饰电极上的微分脉冲伏安图和标准回归曲线

2.6 重现性和稳定性

按1.3.2方法及优化条件制备10支poly－LAsp／MWCNTs／GCE修饰电极，采用微分脉冲伏安法对2.4×10－5mol／L的GA进行重复性试验测定研究，测定结果的GA的氧化峰电流的平均值为3.02 μA，相对标准偏差（RSD）为3.2%，表明该法制备的修饰电极具有良好的重现性。

同样方法制备 1支 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极，对2.4×10－5mol／L的GA进行6次测定，平均响应电流（3.18±0.02）μA，相对标准偏差为2.03%。同样方法制备修饰电极置于4℃的冰箱保存，1周后其电流响应为初始电流响应值的93%，4周后电极响应为到初始值的85%。由此表明本研究制备 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极具有良好的重现性与稳定性。

2.7 小麦麸皮中酚酸的测定

利用 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极测定了小麦麸皮中酚酸的含量，为了验证该方法的有效性，同时利用Folin－Ciocalteu比色法测定同一样品中的酚酸，并加以对比，测定结果如表1所示，试验结果表明本研究开发的poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修饰电极法的测定结果与Folin－Ciocalteu比色法一致。

表1 小麦麸皮中束缚型酚酸的测定和加标回收率（n＝6）

3 结论

用电聚合法及吸附法耦联技术制备了poly－LAsp／MWCNTs／GCE修饰电极，该修饰电极对 GA的氧化具有显著的催化作用。

用循环伏安法研究了GA在该电极上的电化学行为，并对分析条件进行了优化，该修饰电极对GA的催化氧化电流与其浓度在2×10－6～5.6×10－5mol／L范围内呈良好的线性关系，该方法最低检测限为7.6×10－7mol／L。用该纳米修饰电极测定小麦麸皮中束缚型酚酸，其测定结果与Folin－Ciocalteu比色法的测定结果一致，且具有简便、快速、灵敏的优点。

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Preparation of Poly－L－Aspartic acid／MWCNTs Modified Electrode for Fast Determination of Phenolic Acid in Wheat Bran

Wang Liran Li Shuguo

（Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018）

The poly－L－Asp／MWCNTs modified electrodes have been prepared combined with electro－polymerization and absorption method.The voltammetry behavior of gallic acid on the poly－L－Asp／MWCNTs modified electrode has been studied.A new method to determine phenolic acid in wheat bran by differential pulse voltammetry was established.In disodium hydrogen phosphate and citric acid buffer solution（pH 3.0），the modified electrode showed a strong electrocatalytic activity on the oxidation of gallic acid；the electrode reaction of gallic acid was an adsorption control process.On optimized conditions，the calibration curves of determination of gallic acid in foods showed an excellent linear response in range 2×10－6～5.6×10－5mol／L with detection limit of 7.6×10－7mol／L.The developed method was successfully applied in the determination of total phenolic acid in wheat bran；the results of（1 130.8±4.50）μg／g were well consistent with the national standard method as Folin－Ciocalteu colorimetric method（1 180.7±8.18）μg／g.It is feasible to use poly－L－Asp／MWCNTs modified electrodes for fast determination of phenolic acid in food with less requirement of chemical reagent.

phenolic acid，Nano Modified Electrode，wheat bran，fast determination

TS207.3

A

1003－0174（2015）04－0130－06

国家自然科学基金 （20876165），河北省教育厅科技项目（2009329）

2013－12－31

王丽然，女，1988年出生，硕士，食品科学与安全

李书国，男，1969年出生，教授，粮油食品科学与安全技术