韩长志，李瑞强

(西南林业大学林学院，云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明650224)

球花石楠Photinia glomerata Rehd．et Wils．作为云南省重要的乡土树种，已经广泛用于城市绿化和景观设计，但是近年来球花石楠黑斑病在昆明地区发病呈逐渐严重趋势，成为影响城市绿化的重要因素之一。作者通过前期对球花石楠黑斑病的病害调查以及病原菌分离、鉴定，明确该病害是由链格孢属Alternaria Nees真菌引起［1］。本研究从不同培养基、温度、pH值、光照、通气条件以及不同碳源、氮源等方面，对球花石楠黑斑病菌的生物学特性进行研究，以期解释链格孢属真菌寄主范围较广、分布较广的原因，也为进一步研究该病菌致病原因和防治提供重要的理论依据。

1 材料和方法

1.1 菌种球花石楠黑斑病菌分离于西南林业大学校园内的球花石楠叶片，将获得的纯培养菌株保存在试管斜面于4℃冰箱中。菌种保藏于西南林业大学植物病理学教研室，菌种编号QHSN-1。

1.2 病原菌生物学特性研究

选择常规培养基PDA培养病菌。即，用打孔器(直径7 mm)将PDA培养基上培养7 d(28℃恒温培养箱、黑暗条件)的病原菌菌落打成菌丝块接种PDA培养基上(不同的培养基、碳源和氮源测试除外)，28℃恒温培养(不同温度测试除外)，观察和描述病菌的菌落特征，用十字交叉法测量菌落直径，统计分析病原菌生长差异。

1.2.1 不同培养基对病原菌菌丝生长的影响 共5种培养基，每种处理5个重复，培养5 d。

①马铃薯葡萄糖培养基(PDA):马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、水1000 mL;②马铃薯蔗糖培养基(PSA):马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂粉20 g、水1000 mL;③燕麦培养基(OA):燕麦片30 g、琼脂粉20 g、水1000 mL;④清水洋菜培养基(WA):琼脂粉20 g、水1000 mL;⑤玉米粉培养基(CMM):玉米粉40 g、蔗糖10 g、琼脂粉20 g、水1000 mL。

1.2.2 不同温度对病原菌菌丝生长的影响 将病原菌分别置于5，11，22，28，37℃的恒温培养箱中培养，每种处理重复5次，培养5 d。

1.2.3 不同pH值对病原菌菌丝生长的影响 在无菌条件下用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的盐酸溶液调节灭菌的PDA培养基pH值，设pH值为3，4，5，6，7，8，9，10，11等9个梯度，每种处理重复5次，培养5 d。

1.2.4 不同光照条件对病原菌菌丝生长的影响

不同光照条件采用光照4 d、黑暗4 d和光照黑暗各2 d(光暗交替)3种处理，黑暗条件用有盖黑色纸筒罩住。每种处理重复5次，培养4 d。

1.2.5 不同通气条件对病原菌菌丝生长的影响

采用培养皿Parafilm胶带封口和不封口2种方法进行。每种处理重复5次，培养5 d。

1.2.6 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 以查氏培养基为基础，以不加碳源为对照，用含有相当量碳的葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉等多种碳源代替查氏培养基中蔗糖，做成不同碳源的固体培养基，每种处理重复5次，培养5 d。

1.2.7 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 以查氏培养基为基础，以不加氮源为对照，用含有相当氮的硝酸铵、磷酸二氢铵、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸等多种氮源代替查氏培养基中的硝酸钠，做成不同氮源的固体培养基，每种处理重复5次，培养5 d。

1.3 数据统计与分析用Excel 2007对原始数据进行分析、处理和作图。所有图形中的正负偏差均表示标准误(SE)，利用Excel中的程序SE=STDEV(range of values)/SQRT(number)进行计算。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对病原菌菌丝生长的影响球花石楠黑斑病菌除在WA培养基上生长不好外，在其他培养基上都生长较好，尤以在PSA、PDA上生长最快，且菌丝最为密集(图1)。病原菌在不同培养基上所形成的菌落颜色不同，PSA、PDA培养基上的菌落颜色为灰色至黑暗色，而CMM、OA培养基上的菌落则灰色至红褐色(表1)。

图1 不同培养基对病原菌菌丝生长速率的影响

表1 不同培养基上的病原菌菌落形态特征

2.2 不同温度对病原菌菌丝生长的影响从图2可以看到，在设置的11，22，28℃条件下，菌丝均能正常生长，尤以28℃时菌丝生长最快;而在5，37℃条件下，病原菌菌丝不能正常生长，将其转移至28℃条件下继续培养后，菌丝又能恢复生长，说明5℃的低温和37℃高温并未将该病原菌杀死，只是抑制了生长。因此，球花石楠黑斑病病菌生长的最适温度为28℃。后续研究选择该温度对病菌进行恒温培养。

2.3 不同pH值对病原菌菌丝生长的影响在pH 4～11时病原菌都能生长，尤以pH 6～9时病原菌生长较快，其中，pH 8时菌丝生长速率最快，其次为6，7;病原菌在极酸条件(pH为3，4，5)下不能生长，或受到抑制(图3)。可见，病原菌菌丝适宜在中性至偏碱性环境生长，极酸环境不利生长。

图2 不同温度对病原菌菌丝生长速率的影响

图3 不同p H对病原菌菌丝生长速率的影响

2.4 不同光照条件对病原菌菌丝生长的影响 4 d全部光照、4 d全部黑暗以及2 d光照/2 d黑暗(光暗交替)3种光照条件下菌落生长速率仅有较小的差异(图4)，培养性状略有差异，在4 d全部光照条件下病原菌菌丝最密集，菌落颜色最深。

图4 不同光照条件对病原菌菌丝生长速率的影响

2.5 不同通气条件对病原菌菌丝生长的影响利用parafilm封口膜封口的条件下，菌丝生长情况好于不封口的(10．8 mm/d＞10．5 mm/d)，生长速度更快，同时，用parafilm封口可以较好地防止病原菌受到污染，有利于后续试验的开展。

2.6 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 病原菌在所供试的8种含有不同碳源的培养基上都能快速生长，生长速率差异较小;在不加碳源为对照的培养基上，菌落形态较为稀疏，且颜色很浅(图5)。

图5 不同碳源对病原菌生长速率的影响

上述结果表明，病原菌的正常生长与碳源关系非常密切，其可利用的碳源种类较为丰富，尤以麦芽糖最佳。

2.7 不同氮源对病原菌生长的影响病原菌在以蛋白胨、甘氨酸和硝酸钠作为氮源的条件下生长速率较快，且菌丝形态较为密集、菌落较厚，而在不加氮源为对照的培养基上，菌落形态极为稀疏，且颜色极浅;另外，以磷酸二氢铵、硫酸铵作为氮源时，病原菌生长受到抑制(图6)。

图6 不同氮源对病原菌菌丝生长速率的影响

3 结论与讨论

球花石楠的树冠圆整、叶片光绿，以及在不同季节所具有的观赏价值使其广泛应用于城市园林绿化中。目前，对于球花石楠的研究涉及组织离体培养［2］、种子育苗［3］以及胁迫条件下体内生理特性［4］等方面，对其病害的报道有黑斑病［1］、锈病［5］等。

本研究以球花石楠黑斑病菌为研究对象，通过不同培养基、温度、pH、光照、通气状况、碳源、氮源等条件对菌丝生长的影响研究表明，该病原菌生长最适条件为PDA，28℃，封闭，pH 8，碳源为麦芽糖，氮源为蛋白胨，其酸碱度的适应范围较广。同时，为了更好地研究光照条件对病菌菌丝生长的影响，本研究对光照条件的设置并未使用常规的8 h光照/16 h黑暗、12 h光照/12 h黑暗以及16 h光照/8 h黑暗，而是将光照、黑暗条件进行极端化处理，设置4 d全部光照、4 d全部黑暗以及2 d光照/2 d黑暗(光暗交替)3种处理，明确该病菌可以较好地利用不同的光照条件。上述结果对于解释该菌侵染寄主范围较广、分布较广的原因，也为进一步开展对病原菌的侵染循环、发生规律以及防治方法等方面的研究奠定重要的理论基础。

此外，本研究明确球花石楠黑斑病菌的正常生长与氮源关系非常密切，其可利用的氮源种类较为丰富，尤以蛋白胨最佳。该病原菌不能利用某些氮源，推测其体内可能缺少相关酶类，这为进一步采用这些氮源作为营养剂来防治病原菌提供了理论依据。

［1］ 韩长志，李瑞强．球花石楠黑斑病病害调查及病原鉴定初报［J］．中国森林病虫，2014(5):8-9．

［2］ 林萍，普晓兰．球花石楠离体培养及快速繁殖研究［J］．植物研究，2003(3):280-284．

［3］ 白平．球花石楠种子育苗技术［J］．福建林业科技，2011(1):86-88．

［4］ 黄晓霞，黄大韧，杨自云，等．土壤干旱与盐胁迫对球花石楠幼苗生理特性的影响［J］．北方园艺，2010(21):87-89．

［5］ 蔡灿，伍建榕．球花石楠锈病病原物的初步研究［J］．北方园艺，2008(1):208-210．