吴叶莲，肖春玲

（山西师范大学工程学院，山西临汾041004）

酶解法提取黑米多糖的研究

吴叶莲，肖春玲*

（山西师范大学工程学院，山西临汾041004）

以去皮脱脂的黑米为原料，研究了纤维素酶对黑米中多糖的提取率的影响，实验采用单因素试验法研究了在酶解浓度、酶解温度、酶解时间、pH值4个因素下对黑米多糖提取率的影响，选出了影响较大的3个因素；然后用星点设计优化法对实验数据进行进一步优化，确定了最优的提取工艺参数。结果表明：在pH6.0，酶解温度52℃，酶解时间2.5 h，酶浓度3mg/100mL的条件下，黑米多糖得率为0.435 3%。各因素对多糖得率的影响依次为酶解时间＞pH＞酶解温度。

黑米；多糖；酶解法；星点设计优化法

黑米外表墨黑，营养丰富，有“黑珍珠”和“世界米中之王”的美誉[1]。黑米的主要营养成分（糙米），按占干物质计，含粗蛋白质8.5%～12.5%，粗脂肪2.7%～3.8%，碳水化合物75%～84%，粗灰分1.7%～2%[2]。含有大米所缺乏的VC、叶绿素、花青素、胡萝卜素及强心甙等特殊成分，此外，还含有多种维生素和锌、铁、钼、硒等必需微量元素[3]。用黑米熬制的米粥香甜滋润，软糯适口，营养丰富，是滋补、养颜的必备良方。

现在人们对黑米中的花青素的提取、纯化及其体内抗氧化活性研究研究比较清楚，但对黑米中的多糖的提取的研究还少见报道。目前多糖提取主要采用热水浸提、碱浸提、酸浸提[4]等化学方法。而随着生物技术的发展，酶的来源愈来愈多[5]。本项目拟研究用酶解法提取黑米多糖，以期为黑米的进一步开发利用提供参考。

1材料和方法

1.1 材料与试剂

黑米购于北京群鑫工贸有限公司；无水葡萄糖标准品，纤维素酶（30 u/mg）购于华科生化试剂商城；石油醚、无水乙醇、乙醇（95%）、浓硫酸、苯酚、柠檬酸和氨水均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

pHS-3TC精密数显酸度计：上海沪粤明科学仪器有限公司；FA-1004型电子天平、RJ-TDL-40C台式低速大容量离心机：上海精科实业有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计：金城市金城国胜实验仪器厂。

1.3 方法

去皮脱脂黑米粉的制备：选择优质的黑米于45℃水中浸30min，在65℃下烘干，用高速粉碎机磨粉，过60目筛得粉末，用石油醚脱脂，常温下干燥并保存。

多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法[6]测定黑米中多糖的含量。建立的回归方程为：y=0.056 5x-0.006 2，（R2=0.999 7，0μg/mL～14μg/mL），其中横坐标表示葡萄糖浓度，纵坐标表示吸光度。多糖的得率%=粗提物中含有的多糖质量/最初黑米粉的质量×100%[7]。

酶解法提取黑米多糖的过程：称取1 g黑米粉于100mL烧杯中，定容到50mL混匀。加入酶并调节不同的pH、温度、浓度、时间。在黑米粉溶液中加入6mL[8]的酶溶液，于水浴锅中加热反应2 h，调节至90℃历时30min，使酶钝化，在3000 r/min的条件下离心10min[9]，取出溶液的上清液，加入95%的乙醇溶液静置，确保充分沉淀。去掉上清液，再次用相同转速离心剩下的液体历时15min。用无水乙醇洗涤沉淀，干燥后得到粗多糖。最后，用蒸馏水溶解粗多糖，加入5mL苯酚、1mL硫酸摇匀，测其吸光度。

提取黑米多糖的单因素试验：分别考察pH（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0）、酶解温度（30、40、50、60、70、80℃）、酶解时间（1、2、3、4、5、6 h）、酶浓度（0、1、2、3、4、5mg/100mL）对黑米多糖提取率的影响[10]。

酶解法提取黑米多糖的星点优化设计实验[11]：根据单因素实验的结果，从4个因素中筛选出3个影响多糖得率较大的因素。使用响应面优化设计软件对这3个因素进行优化分析，进一步确定黑米多糖的最佳提取工艺参数。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 不同pH对黑米多糖得率的影响

图1表示不同pH条件下黑米多糖的得率。

图1 不同pH条件下黑米多糖的得率Fig.1 The yield of black rice polysaccharide in different pH

图1表明，黑米多糖的得率是随着pH的变大在逐渐增大，当pH增加到6.0时，出现最高值。pH继续增大得率反而下降，这是因为pH的大小直接影响酶活性，酶活性下降，将直接导致多糖得率下降[12]。因此影响黑米多糖酶解的最适pH是6.0。

2.1.2 酶解温度对黑米多糖得率的影响

图2表示不同温度下黑米多糖的得率。

图2 不同温度条件下黑米多糖的得率Fig.2 The yield of black rice polysaccharide in different temperature

图2 显示，随着温度的升高，多糖的得率变大，50℃时多糖的得率达最大值0.101 4%，但随着温度的持续升高，多糖的得率反而降低。因为温度既会影响多糖的浸出速度，还将影响酶的活性的大小[13]，由此多糖的最佳酶解温度为50℃。

2.1.3 酶解时间对黑米多糖得率的影响

图3表示了不同酶解时间下黑米多糖的得率。

图3 不同时间条件下黑米多糖的得率Fig.3 The yield of black rice polysaccharide in different time

从图3看出，多糖的得率在2 h出现了最高值达0.142 7%。如果继续增加反应时间，多糖的得率反而会下降，这是因为反应时间越长，反应越充分，但是并不是多糖的得率会越大。因此黑米多糖的最佳酶解时间为2 h。

2.1.4 酶浓度对黑米多糖得率的影响

图4表示不同酶浓度对黑米多糖得率的影响。

图4 不同酶浓度下黑米多糖的得率Fig.4 The yield of black rice polysaccharide in different concentration

从图4看出，黑米多糖的得率会随着酶浓度的增加而逐渐增加，当浓度达到3mg/100mL的时候，多糖的得率为最大达到0.1297%。浓度继续增加多糖的得率并没有增大。因此黑米多糖的最佳酶浓度为3mg/100mL。2.2 星点优化设计试验

2.2.1 实验设计

根据上述单因素的试验结果，选择纤维素酶最适酶浓度为3mg/100mL，确定对多糖得率产生影响较大的X1（pH）、X2（酶解温度）和X3（酶解时间），以多糖得率Y为考察指标来进行三因素五水平的星点设计（CCD）[14]，其中因素和水平见表1。

表1 星点设计因素水平表Table1 Ariables and codes of central composite design

2.2.2 星点试验设计结果

星点实验结果见表2。

表2 星点实验设计及结果Table2 Factors and response of central composite design

表3 回归模型方差分析表Table3 Regression model analysis of variance table

用软件Design Expert8.0.6分析处理数据，得方程Y=0.43＋0.019X1＋0.018X2＋0.049X3-0.011X1X2＋3.938E-003X1X3＋0.017 7X2X3-0.069X12-0.082X22-0.056X32。其中：Y为多糖得率的预测值；X1为pH的编码值；X2为酶解温度的编码值；X3为酶解时间的编码值。进一步优化得X1=0.14，X1=0.15，X3=0.46，Y=0.441 0%，由表3知，回归模型P值＜0.05，可知该模型显著；模型失拟项不显著，说明选择该模型合适。因素X1（pH）、X2（酶解温度）、X3（酶解时间）及X1X2、X2X3、X1X3对黑米多糖得率的交互影响是不显著的，X12、X32的影响是显著的，X22的影响是极显著的。这说明实验中的各个因素与数值之间未表现出简单的线性关系。由单因素F值的大小可判断，各因素对黑米多糖得率的影响顺序为：酶解时间＞pH＞酶解温度。

经过分析可知，采用纤维素酶法提取黑米多糖的最佳条件为pH6.14，酶解温度51.5℃，酶解时间2.46 h，黑米多糖得率为0.441 0%。为了实际操作方便，黑米多糖的最佳提取条件为pH6.0，酶解温度为52℃，酶解时间为2.5 h，然后进行实验验证多糖的得率为0.435 3%，与理论值的接近程度为98.71%。实验优化得到的参数可行，进一步验证了数学回归的可行性。

3 结论

在单因素试验的基础上，对纤维素酶的提取参数采用星点设计实验优化，所得结果为：在pH6.0，酶解温度52℃，酶解时间2.5 h，酶浓度3mg/100mL，在此条件下，黑米多糖的理论得率为0.435 3%。由星点曲面和等高线图可知，pH、酶解温度、酶解时间对多糖得率的影响的强弱顺序依次为酶解时间＞pH＞酶解温度。

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Research on Extraction of Black Rice Polysaccharide by Enzymolysis Method

WUYe-lian，XIAOChun-ling*
（College of Engineering，Shanxi Normal University，Linfen 041004，Shanxi，China）

This experiment took black rice as raw material and used the cellulose enzymatic on the extraction of black rice polysaccharide.The single-factor test methods were used to investigate the influence of enzyme concentration，reaction temperature，hydrolysis time and pH.Based on it，three main influence factors are chosen.The experiment data were further optimized using the central composite design and the optimal parameters of the extraction process was determined.The results show that：The optimal parameters of extraction process are：pH is 6.0，reaction temperature is 52℃，hydrolysis time is 2.5 h and the enzyme concentrationis 3mg/100mL.Uunder this condition，polysaccharide content in black rice is 0.435 3%.Effects of different factors on the polysaccharide yield are distinct and the order is：enzymatic hydrolysis time＞pH＞hydrolysis temperature.

black rice；polysaccharide；enzymatic hydrolysis；central composite design

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.010

2013-10-06

山西师范大学大学生创新项目（SD2012CXSY-48）；山西师范大学科研课题组（873041）

吴叶莲（1992—），女（汉），本科，学士，研究方向：食品科学。

*通信作者：肖春玲（1966—），教授，硕士，研究方向：天然产物的提取。