刘红新，任艳，张冬蕾，杨彦荣，刘文俊，孙天松

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018）

0 引言

酸马奶（koumiss）是中亚地区传统的发酵马乳饮料,又称“马奶酒”[1]。它以新鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌共同发酵而成，具有独特的风味和丰富的营养价值[2]。蒙医药典中也曾记载酸马奶能开胃、祛湿、解毒润肤等功效[3]。酸马奶之所以具有与马奶不同的功效，主要由于其微生物菌群以酵母菌群和乳酸菌群为主。乳酸菌是指发酵碳水化合物产生乳酸的一类革兰氏阳性、不产芽孢、过氧化氢酶阴性的一类细菌的总称[4]，在人体内具有诸多益生作用[5]。

本研究采用实验室纯培养的方法分离、鉴定锡林郭勒地区传统酸马奶中的乳酸菌，通过16S rDNA序列分析的方法对乳酸菌分离株进行鉴定，并分析其优势菌群，保护我国益生菌资源，为传统酸马奶的筛选和开发利用提供参考。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 样品来源

本研究中27份酸马奶样品由实验室的研究人员于2014年7月16日—2014年7月18日在内蒙古锡林郭勒的不同地区采集。样品采集后低温保存，带回实验室于-80℃超低温保藏，进行后续实验。

1.1.2 培养基与试剂

培养基：MRS固体培养基，MRS液体培养基，M17固体培养基，M17液体培养基。

实验所用试剂：PBS保护液，PBS缓冲液，脱脂乳保护剂，提取DNA所用试剂，PCR扩增和电泳检测所用试剂[6]。

1.1.3 仪器与设备

便携式冰箱，温度计，便携式PH计，采样箱等。

ZHJH-C1214C型超净工作台，TGL-168高速台式离心机，HWS28型电热恒温水浴锅，AR2202CN型电子天平，KDC-1044型低速离心机，LRH-250生化培养箱，BX50型光学显微镜，HA-300M型全自动高压蒸汽灭菌器，SP-650型全自动高压干热灭菌器，WD-9405B型水平摇床，LL-6SFPY型真空冷冻干燥机，PTC-200梯度基因扩增仪；DYY-12型电泳仪，GDS-8000型凝胶成像仪，ND-1000型微量紫外分光光度计等。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

本试验在采集乳样品时采用直接取样法。先将容器中的发酵乳制品充分混匀，再用移液枪吸取1.5 mL样品至装有灭菌中和剂（内含0.5 g,CaCO3：淀粉=1∶50，质量比）的2.5 mL无菌螺口冻存管中，混匀后标记样品号并作记录，封口保存。最后将采集的乳样置于4℃便携式冰箱中以维持其低温状态，尽快带回实验室进行乳酸菌的分离纯化等实验。

1.2.2 样品中乳酸菌的计数

乳酸菌计数根据参考文献[7]采用倾注培养法。计数即为每mL样品的菌落数。

1.2.3 样品中乳酸菌的分离纯化及保存

分别吸取 0.2 mL稀释度为10-5，10-6，10-7稀释液于MRS固体培养基上涂布后置于37℃恒温培养箱中厌氧培养48 h，待菌落形成后，随机挑取形态学特征各不相同的单个菌落于相应的液体培养基中，37℃培养24 h。将不纯的菌株在MRS固体培养基上划线分离，37℃培养48 h，如此反复2～3次，直至镜检结果为纯的单菌后编号并接种于相应液体培养基进行扩培和传代。

选取过氧化氢阴性、革兰氏阳性的纯培养物，将此培养物暂定为乳酸菌，加入质量分数为0.1%谷氨酸钠的脱脂乳保护剂，混匀后置于-80℃保存备用。同时，另一份样品进行DNA提取和后续鉴定实验。

1.3 16S rDNA序列分析

1.3.1 总DNA的提取及纯度的检测

采用液氮反复冻融-CTAB法提取乳酸菌基因组DNA[8]。再用ND-1000型微量紫外分光光度计测其浓度以及OD260/280值。再用质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.2 16S rRNA基因的PCR扩增

16S rRNA基因的PCR扩增引物序列为

FA-27F：5'-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

RA-1495R：5'-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3'[9]。

PCR扩增体系（模板为上述DNA稀释液）：5 μL10×EasyTaq Buffer（+Mg2+）；4 μL High Pure dNTPs（2.5 mmol/L）；1.5 μL 引物 FA-27F（浓度 10 mmol/L）；1.5 μL 引 物 RA-1495R（10 mmol/L）；0.5 μL EasyTaq DNA polymerase（5 U/μL）；2 μL DNA 模板（质量浓度100 ng/μL）；35.5 μL ddH2O。

PCR扩增循环参数为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；72℃末端延伸10 min。

扩增完毕后，取约2 μL的PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，若在1 500 bp处有清晰的扩增条带且无拖尾、弥散现象，则PCR扩增成功[10]。将PCR扩增产物送往上海美吉生物公司进行纯化和DNA测序。

1.4 同源性分析

将测序得到的DNA序列运用SeqMan（DNAStar 5.01）软件进行序列拼接后，再利用NCBI中的BLAST将拼接好的序列与数据库中已鉴定的乳酸菌16S rDNA序列进行同源性分析，将待鉴定菌株序列与同源性最高的模式菌株序列应用MEGA 4.0（http：//www.megasoftware.net）软件构建系统发育树，进行遗传进化研究。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌分离株的菌落形态及细胞形态特征

根据乳酸菌的形态学特征[11-12]，初步从27个酸马奶样品中共分离出83株疑似乳酸菌的菌株。经过革兰氏染色、过氧化氢酶反应，均为革兰氏阳性，过氧化氢阴性菌[13]。初步将83株菌定为乳酸菌。

2.2 乳酸菌计数结果

锡林郭勒地区酸马奶中乳酸菌的活菌数如表1所示。

由表1可以看出，酸马奶样品中乳酸菌数在4.44～8.99 mL-1（对数值）之间。平均值为（6.09±0.13）mL-1（对数值）。其中XM3，XM4，XM14等样品中乳酸菌活菌数低于106/mL-1，低于酸奶国家标准。大部分菌株的活菌数高于106mL-1，符合新的酸奶国家标准和国家卫生标准，有利于进一步分离与研究。由于本次采样，并未按照特定时间点进行，是随机采样，有的地点样品发酵和贮藏时间长，有的样品发酵和贮藏时间短，所以其中乳酸菌活菌数量存在较大差异。李道敏,刘开永等人[14]对木糖醇酸奶发酵、贮藏期间质量变化做过研究，闫志国[15]对发酵乳在贮藏期间的理化性质的变化也做过详细报道，均阐述自然发酵乳制品中微生物随着发酵和贮藏时间的延长，乳酸菌种属和数量有较大的变化。

表1 内蒙古锡林郭勒地区酸马奶中乳酸菌计数结果 mL-1

2.3 乳酸菌分离鉴定结果

2.3.1 DNA提取和PCR扩增结果

DNA浓度和OD260/280值的测定：提取83株乳酸菌的DNA并测其浓度以及OD260/280值，OD260/280值在1.8～2.0之间即为纯DNA样品。将DNA原液稀释至浓度为100 ng/μL后进行16S rRNA基因的PCR扩增。扩增结果经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，可以观察到在大约1 500 bp的位置处有一条清晰明亮的条带，并且无拖尾、弥散现象，未发现明显非特异扩增现象，说明分析菌株的16S rRNA基因扩增成功。将PCR扩增产物送于上海美吉生物科技有限公司进行测序。

图1 部分分离菌DNA琼脂糖凝胶电泳

2.3.2 16S rRNA基因同源性比对及系统发育树构建

将测序获得的16S rRNA基因序列通过NCBI数据库中BLAST进行同源序列比对分析,若同源性高于99%则可直接将其归为此种模式株菌种，选取部分具有代表性的菌株用 MEGA 4.0（http：//www.megasoftware.net）软件构建系统发育树。分离株与模式株系统发育树见图2（选取部分作图）：

图2 内蒙古锡林郭勒地区代表性分离株的16S rRNA基因序列的系统发育树

由图2可以看出，所有分离株聚为2个大的类群，一个类群为杆菌，一个类群为球菌，IMAU11650（KR858843）与模式菌Enterococcus durans ATCC19432（AJ276354）聚为一类，同源性分别为100%，将其鉴定为 Enterococcus durans。IMAU11655（KR858848）与模式菌Enterococcus faecium ATCC19434（AJ301830）聚为一类，同源性为100%，因此将归其为Enterococcus faecium。IMAU11642（KR858836）与模式菌Enterococcus devriesei CCM7299（AJ891167）聚为一类，同源性为99%，故将其鉴定为Enterococcus devriesei。IMAU11152（KR858806）与模式菌Enterococcus faecalis JCM5803（AB012212）聚为一类，同源性为100%，故鉴定为Enterococcus faecalis。IMAU11668（KR858860）与模式菌Enterococcus italicus DSM 15952（AJ582753）聚为一类，同源性为 100%，故将其鉴定为Enterococcusitalicus。IMAU11124（KR858778）与模式菌Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC19435（AB100803）聚为一类，同源性为100%,故鉴定为Lactococcus lactis subsp.Lactis。IMAU11138（KR858792）与模式菌Streptococcus parauberis DSM6631（AY584477）聚为一类，同源性为99%，故将其归为为Streptococcus parauberis。IMAU11641（KR858835）与模式菌Lactobacillus plantarum ATCC14917（AJ965482）聚为一类，同源性为100%，故将其鉴定为Lactobacillus plantarum。IMAU11674（KR858866）与模式菌Lactobacillus diolivorans DSM14421（AF264701）聚为一类，同源性为100%，故将其鉴定为Lactobacillusdiolivorans。IMAU11656（KR858849）与Lactobacillus casei ATCC393（AF469172）聚为一类，同源性为99%，故将其鉴定为Lactobacillus casei。 IMAU11657（KR858850）与模式菌Lactobacillus paracasei ATCC25302（D79212）聚为一类，同源性为100%，因此将其鉴定为Lactobacillus paracasei。IMAU11644（KR858838）与模式菌Lactobacillus helveticus ATCC15009（AM113779）聚为一类，同源性分别为99%，故鉴定为 Lactobacillus helveticus。IMAU11126（KR858780）与模式菌 Lactobacillus kefiranofaciensDSM 5016（AM113781）聚为一类，同源性为99%故，将其鉴定为Lactobacillus kefiranofaciens。IMAU11158（KR858812）与模式菌 Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC12291（AB023237）聚为一类，同源性分别为99%，故鉴定为Leuconostoc pseudomesenteroides。IMAU 11125（KR858779）与模式菌Leuconostoc mesenteroides NCFB529（AB023244）聚为一类，同源性为99%，故将其鉴定为Leuconostoc mesenteroides。根据16S rDNA序列分析，分离的83株菌中，49株菌与模式菌株的同源性达到99%，34株菌与模式菌株的同源性达到100%。

2.4 锡林郭勒地区酸马奶中乳酸菌的优势菌种分析

乳酸菌的分布结果如表2所示。

表2 内蒙古锡林郭勒地区酸马奶中乳酸菌的分离结果

由表2可以看出，27份酸马奶样品中分离出的83株乳酸菌疑似菌株，经16S rDNA序列测定和同源性分析鉴定，分属于5个属15个种或亚种。其中锡林郭勒地区的优势菌群为Lactococcus lactis subsp.lactis，占总分离株的34%。近几年，孙天松[16]等人对新疆地区酸马奶进行分离鉴定，其优势菌种为Lactobacillus helveticus。刘芳、都立辉[17]等人对内蒙古酸马奶多样性进行研究，发现Lactococcus lactis为优势菌群。魏艳、曾小群[18]等人对新疆酸马奶中乳酸菌分离鉴定，结果表明优势菌群为发酵乳杆菌和干酪乳杆菌。由此可见不同地区酸马奶优势菌种不同，即使同一地区采样时间、贮藏时间不同，结果也会有差异。

3 结论

本研究对27份锡林郭勒地区酸马奶样品进行乳酸菌的分离鉴定，共分离出83株乳酸菌。通过16S rDNA序列同源性分析，将83株乳酸菌鉴定为5个属，15个种或亚种，分别属于乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、肠球菌属、链球菌属。其中Lactococcus lactis subsp.Lactis为锡林郭勒地区酸马奶中的优势菌种，占总分离株的34%。

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