均匀设计法优选肝豆汤的效应中药配伍

——以TX小鼠神经细胞内Bcl-2、Bax蛋白表达水平

及血清和脑组织中铜含量为指标

汪世靖1,2，赵雯1,2，陈林1,2，董健健1,2，程楠2，韩永升2，胡文彬2，韩咏竹2

(1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥230038；

2.安徽中医药大学神经病学研究所附属医院，安徽 合肥230061)

[摘要]目的基于均匀设计法筛选中药复方肝豆汤保护TX小鼠神经细胞的效应中药。方法基于“6因子11水平表”均匀设计法，以神经细胞内Bcl-2、Bax蛋白表达水平及血清和脑组织中铜含量为指标，以TX小鼠为Wilson病动物模型，采用多元逐步回归分析法优选肝豆汤中6种药物(大黄、姜黄、黄连、泽泻、金钱草、三七)的效应中药配伍。采用Western blot法以及等离子质谱法分别测定细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和血清、脑组织铜含量。结果与对照组比较，TX小鼠脑组织中Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)，Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，脑组织铜含量显著升高(P<0.05)，血清铜含量显著降低(P<0.05)。多元逐步回归分析结果显示，姜黄和大黄分别进入血清铜含量及脑组织铜含量的回归方程，黄连和泽泻均进入脑组织Bcl-2和Bax表达水平的回归方程，姜黄和金钱草分别进入神经细胞Bcl-2/Bax的回归方程，三七均未进入上述指标的回归方程。结论肝豆汤中大黄、姜黄、黄连、泽泻、金钱草配伍组合，可通过多靶点保护TX小鼠神经细胞；三七在保护TX小鼠神经细胞过程中未发挥明显效应。

[关键词]均匀设计法；肝豆汤；效应中药；配伍

[中图分类号]R742.4；R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.05.021

项目基金基金资助：安徽省科技攻关计划项目(12010402114)；国家自然科学(81473535)

作者简介：汪世靖(1989-)，男，硕士研究生

收稿日期：(2015-05-07；编辑：姚实林)

肝豆状核变性又称Wilson’s病(Wilson’s disease，WD)，是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍疾病[1]，其主要临床表现为肝脏损伤和脑损伤症状，其中40%～60%的WD患者存在震颤、肌僵直、言语不清、流涎、步态异常等脑损伤临床表现[2]。韩咏竹等[3]采用中西结合方法治疗WD，所用肝豆汤对具有神经系统症状的WD患者疗效明确。均匀设计法[5]是一种将数论和多元统计相结合，以较少实验次数优化最佳实验参数的实验方法，具有“均匀分散”及方便、实用、预测性好的特性，对多因素、多水平的实验研究较为适用。由于中药复方具有药味较多(多因素)、剂量不等(多水平)的特点，因此，从理论上看，将药效学与均匀设计法相结合，应用到中药复方研究是可行的。本课题组既往曾采用均匀设计法优选了益气化痰方抗抑郁不同作用途径的效应中药配伍[4]，在此基础上，本研究以中药复方肝豆汤中6种药物(大黄、黄连、泽泻、姜黄、金钱草、三七)为对象，运用均匀设计法对肝豆汤中保护神经细胞的效应中药进行筛选。

通信作者：韩咏竹，hyz89722@sina.com

1　材料

1.1主要试剂与器材兔抗Bcl-2、Bax多克隆一

structure of mitochondria was complete, there was not mitochondria swelling, and chromatin were evenly distributed; in the middle- and low-dose GTKPM groups, the vascular wall was integral, some VECs were swelling, the nuclear membrane was intact, the dilatation of rough endoplasmic reticulum was observed, the ribosomes slightly decreased, and mitochondria swelling and vacuolar degeneration were observed in some mitochondria. ConclusionGranules for tonifying the kidney and preventing miscarriage can repair the damaged cellular structure in decidual tissue of RSA mice, who have impaired angiogenesis at the maternal-fetal interface, and improve angiogenesis and the integrity of cell organelle to play the role of miscarriage prevention.

[Key words] granules for tonifying the kidney and preventing miscarriage; recurrent spontaneous abortion; decidual tissue; ultrastructure

抗均购于英国Abcam公司，二抗均为Abcam公司辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG；Fine Do X6全自动化学发光图像分析系统：上海天能科技有限公司提供，用于蛋白条带显色。WX-3000微波消解仪：由上海屹尧公司提供，用于脑组织及血清的消解；XSERAES Ⅱ等离子体质谱仪及ACAT-6300等离子体光谱仪：由美国热电公司提供，用于微量元素检测。

1.2实验药物肝豆汤组成药物(大黄、姜黄、黄连、泽泻、金钱草、三七)：均购于北京同仁堂药店安徽合肥分店，采用传统水煎提取工艺制备成各实验组对应药物，4 ℃冰箱保存备用。

1.3实验动物实验动物为WD模型TX小鼠，由10对TX小鼠种鼠(从美国Jackson实验室引进)饲养于安徽医科大学SPF实验动物中心，并进行传代繁殖。饲养环境温度18～20 ℃，相对湿度45%～65%。模型动物在入组前随机选择3只进行铜生化指标(铜蓝蛋白、铜氧化酶、血清铜等)和基因检测以确保种鼠及其子代的遗传均一性。

2　方法

2.1运用均匀设计方案[5]进行实验分组选用U11*(118)(8因子11水平)表，将肝豆汤原方中6味中药(大黄、姜黄、黄连、泽泻、金钱草、三七)作为考察因子，每个因子各取11个水平(每个水平为10 g小鼠每日给药量，依据《中华人民共和国药典》所规定的成人每日最大用药量，再根据动物实验方法学[6]换算得出小鼠的用药剂量约为成人的10倍)，规定大黄、姜黄、黄连分别在0～4.00 g的剂量范围内递增11次，泽泻、金钱草分别在0～4.80 g的剂量范围内递增11次，三七在0～0.60 g的剂量范围内递增11次。同时根据U11*(116)均匀设计表安排各因子和水平，进行组方设计。见表1。

表1　 按U 11*(11 6)均匀设计方案确定的实验组方

2.2实验动物分组与给药WD模型TX雄性小鼠72只(2月龄)，3月龄6只，SPF级，体质量(22～23.5)g；另取2月龄、3月龄野生型(the wild type, DL)小鼠各6只，作为正常对照组。模型组为2月龄、3月龄各6只；其余2月龄66只TX雄性小鼠按随机分组原则分为11个“药物组”(组号1～11，每组6只)。药物按表1均匀设计方案，按其剂量配比要求配制各组灌胃液，配制浓度均以达到22 g小鼠灌胃要求为准。模型组和正常对照组同时予以相同容积的饮用水，灌胃时间1个月。

2.3标本取材各小鼠称质量，于腹腔内注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)，麻醉成功后将小鼠摘眼球取血后固定于手术台，打开胸腔，暴露心脏，从心尖处剪一个3 mm左右的切口，将12号乳鼠灌胃针头经心尖插入左心室，剪开右心耳，向心脏输注生理盐水，再移动灌胃针使之插入主动脉，确定灌胃针头进入主动脉后，用血管钳将针头和心脏夹住固定，快速灌注4 ℃生理盐水，当右心耳处有澄清液体流出，肝脏变白时，完整取出脑组织，置于-80 ℃冰箱冻存。

2.4Western bolt法检测Bcl-2、Bax表达水平将所取得的TX小鼠脑组织标本按每20 mg组织加入200 μL裂解液(含PMSF)，待组织充分裂解后，将组织混悬液移至1.5 mL离心管中，离心后吸取上清液，保存备用。将制备好的蛋白样品采用SDS-PAGE电泳法电泳后，滴加一抗，4 ℃孵育过夜，次日取出，用PBS液冲洗后，室温孵育二抗2 h，ECL显色，用Quantity one灰度值分析软件进行分析，同时以GAPDH蛋白表达水平作为参照，以所测蛋白条带灰度值/GAPDH灰度值作为所测蛋白相对表达水平。

2.5等离子质谱法检测血清和脑组织中铜含量分别取200 μL血清及0.15～0.2 g脑组织标本，将200 μL血清同200 μL超纯水放入消融试管中，加超纯硝酸600 μL充分混匀，再用超纯水定容至5 mL备用；另将脑组织经双蒸水反复冲洗表面血液后，再用滤纸吸干组织表面水分，装入微波消解罐内，加入8 mL超纯浓硝酸，放入微波消解器中消解，最后将消解后的标本定容至10 mL备用。采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry, ICP-AES)测定血清和脑组织标本中铜含量。

3　结果

3.1模型因素和月龄因素对小鼠脑组织Bcl-2、Bax含量，Bcl-2/Bax和血清、脑组织Cu含量的影响两因素方差分析结果(见表1)显示，月龄因素仅对脑组织Bax表达水平、Bcl-2/Bax比值和脑组织Cu含量的主效应具有统计学意义(P<0.05)，模型因素对所有指标的主效应均具有统计学意义(P<0.05)，月龄因素和模型因素对所有指标的交互作用也具有统计学意义(P<0.05)。简单效应分析结果(见表2)显示，与正常组比较，TX组脑组织Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05)，Bax表达水平显著降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax显著升高(P<0.05)，血清Cu含量显著升高(P<0.05)，脑组织Cu含量显著降低(P<0.05)。各组Bcl-2和Bax蛋白的典型电泳结果见图1。

表1　模型因素和月龄因素对小鼠脑组织Bcl-2、Bax含量，Bcl-2/Bax和血清、脑组织Cu含量影响的两因素方差分析结果

表2　不同月龄正常组和TX组小鼠脑组织Bcl-2、Bax相对表达水平，Bcl-2/Bax和血清、脑组织Cu含量比较

注：与同组2月龄比较，*P<0.05；与同月龄正常组比较，#P<0.05。

注：1.模型组；2.对照组；3.肝豆汤组方1；4.肝豆汤组方2；5.肝豆汤组方3；6.肝豆汤组方4；7.肝豆汤组方5；8.肝豆汤组方6；9.肝豆汤组方7；10.肝豆汤组方8；11.肝豆汤组方9；12.肝豆汤组方10；13.肝豆汤组方11。

图1各组Bcl-2、Bax蛋白的典型电泳结果(Western blot法)

3.2多元回归分析法筛选肝豆汤对TX小鼠脑组织Bcl-2、Bax相对表达水平，Bcl-2/Bax和血清、脑组织Cu含量影响的效应中药肝豆汤的组方不同，各指标的水平也不相同，描述性统计结果见表3。分别对各指标的水平和肝豆汤中各药物的剂量进行Pearson相关分析，相关系数见表4，可见各指标的水平与肝豆汤中各药物剂量的相关系数明显不一致。分别以各指标的水平为因变量，以肝豆汤中各药物的剂量为自变量进行多元逐步线性回归分析，以α=0.05作为变量进入回归模型的水准，结果显示，不同药物进入不同指标的回归方程，结果见表5。以Bcl-2为例，yBcl-2=1.449+30.921x黄连-19.460x泽泻，若要Bcl-2表达水平最高，那么x黄连取最大值，x泽泻取最小值；即效应中药的最佳配比为：黄连入肝豆汤组方剂量应为4 g，泽泻入原方剂量应为0 g；以此类推，得出各效应途径的最佳药物配比。

表3　11种肝豆汤组方对TX小鼠脑组织Bcl-2、Bax相对表达水平，

表4　TX小鼠各项指标与肝豆汤中各药物剂量的相关性

4　讨论

WD的主要发病机制是ATP7B基因突变导致的铜代谢障碍[7-8]，患者由于体内大量的铜元素蓄积产生的毒性作用而出现相应的临床表现。铜可从多种途径产生细胞损伤，但其中最主要的理论为铜产生的氧化应激损伤[9]。Bcl-2和Bax分别为Bcl-2家族中典型的抑凋亡和促凋亡蛋白，在接受细胞内

表5　肝豆汤中各药物对TX小鼠脑组织中凋亡蛋白及血清和脑组织Cu含量影响的多元回归分析结果

相关信号分子如活性氧族(reactive oxygen species，ROS)等刺激后，导致细胞色素C的大量释放，后者激活Bax蛋白可形成同源二聚体诱导细胞凋亡，上调Bax与Bcl-2形成异源二聚体促进细胞凋亡，两者均可通过破坏线粒体膜，使得线粒体膜的通透性升高，使细胞内蓄积的Bax、Bak等凋亡蛋白大量释放进入细胞质，最终激活Caspase级联反应，激活Caspase-3信号传导通路，导致细胞凋亡[10]。高铜可以使细胞内ROS升高，线粒体功能失调，激活c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)和Caspase-3信号传导通路，导致神经细胞凋亡[11]。

由表1和表2分析结果可知，TX小鼠血清铜含量明显高于正常对照组小鼠，脑组织中铜含量低于正常对照组小鼠。血清铜含量过高则会通过血脑屏障对脑组织产生损伤。经多元线性回归分析得出，大黄对脑组织中铜元素产生负效应作用，可促进脑组织中过量铜的排出；姜黄可上调血清铜元素的含量，导致血清铜含量升高，从而导致铜毒性；金钱草可以下调血清铜元素的含量而产生保护效应。由此可见肝豆汤降低不同组织中铜含量的效应中药不同。由表1和表2分析结果，Bax为促神经细胞凋亡蛋白，在3月龄TX组小鼠明显升高，提示存在神经细胞损伤；Bcl-2为抑制神经细胞凋亡蛋白，在3月龄TX组小鼠中明显降低，提示脑保护作用下降。经多元线性回归分析可知，黄连可上调两种蛋白的表达，泽泻则可下调两种蛋白的表达，通过比较偏回归系数，可知黄连上调Bcl-2蛋白的效应作用强于上调Bax蛋白，泽泻下调Bax蛋白的作用效应强于下调Bcl-2蛋白；Bcl-2/Bax在脑保护效应中起重要作用，由表1和表2统计分析结果可知，2月龄和3月龄TX小鼠脑组织中Bcl-2/Bax升高，提示存在神经细胞损伤，经多元线性回归分析得出姜黄可下调Bcl-2/Bax，金钱草则可以上调Bcl-2/Bax，从而产生神经细胞保护效应。此外，在上述作用途径与效应中药研究的多元逐步回归方程中，三七均未进入相关指标的回归方程，提示三七在调控Bcl-2、Bax蛋白表达和调控脑组织和血清铜含量的过程中未发挥明显效应，但并不说明三七对神经细胞无保护作用。由此可以推测，大黄、姜黄、黄连、泽泻、金钱草五味中药均具有综合药理作用，是肝豆汤中同时具有驱铜和调控Bcl-2、Bax蛋白表达，保护神经细胞的效应中药，但效应中药之间的具体剂量配比关系尚不能确定，仍有待进一步研究。

根据本研究机构的长期临床实践和观察，WD具有神经系统症状的患者多为肝肾不足型[12]。肝为将军之官，主谋虑，胆主决断；肝为五脏之贼，体阴用阳，五行属木，性喜条达，故古方中治肝病之法多以柔肝缓急、疏肝解郁益肝血为主。WD患者由于先天因素导致多为素体阴虚，且先天禀赋不足，因而极易因先天元阳不足导致阴无以生，出现肝肾阴虚的病理特点。谌宁生[13]认为本病多因为先天禀赋不足，肾精匮乏，精不化血以致精血两虚，筋脉失养，乃至火生风动，故出现脾气暴躁、震颤、肌张力障碍等临床表现；肝木不疏，木旺乘土，以致脾气被遏，运化受阻，痰浊郁毒内生，上犯舌本，出现流涎、构音不良等。王共强等[14]运用中医学络病理论与现代医学观点认为虚、瘀、痰、毒夹杂的本虚标实是WD患者毒损脉络的主要病理特点，铜毒是毒邪致病的根本原因。但也有研究[15]认为，WD乃是脏腑功能失调，铜浊代谢排出障碍，蓄积体内致病的一种毒邪为患。在应用中医药组方配伍时应遵疏肝利胆排毒、清热泻火解毒、健脾助运、升清降浊排毒、通腑利尿排毒、通络活血排毒等方法。肝豆汤中，大黄、黄连清热泻火解毒，其中黄连又兼升清降浊排毒的功效；金钱草利胆退黄解毒；泽泻通腑利尿排毒；姜黄、三七通络活血排毒。诸药相合，契合WD的复杂病机。本研究中，三七并未进入相关指标的回归方程中，但作为临床常用的活血化瘀中药，其是否存在与其他药配伍后发挥协同作用或存在其他药理效应，尚需进一步研究。另外，由均匀设计法分析得出的“最佳配方与剂量配比”是否在特定作用途径下发挥与复方类似的药理效应，也有待进一步研究。

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A Study of Compatibility of Effective Traditional Chinese Medicine Components in Gandou Decoction Based on Uniform Design—Indicated by Protein Expression of Bcl-2 and Bax in Nerve Cells and Content of Copper in Serum and Brain Tissue of TX Mice

WANGShi-Jing1,2,ZHAOWen1,2,CHENLin1,2,DONGJian-jian1,2,CHENGNan2,HANYong-sheng2,HUWen-bin2,HANYong-zhu2

(1.GraduateDivisionofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.AffiliatedHospitalofNeurologyInstitute,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230061,China)

Abstract[] ObjectiveTo screen the effective traditional Chinese medicine (TCM) components in compound Gandou Decoction that are responsible for protection of nerve cells in TX mice based on uniform design. MethodsA uniform design table with six factors and eleven levels was used in this study. The TX mice were used as the animal model of Wilson’s disease, and the indices consisted of the protein expression of Bcl-2 and Bax in nerve cells and the content of copper in serum and brain tissue. Multiple stepwise regression analysis was performed to figure out the compatibility of the six effective TCM components in Gandou Decoction, Rheum officinale, Rhizoma Curcumae Longae, Coptis chinensis, Alisma orientalis, Lysimachia christinae, and Radix Notoginseng. Western blot and plasma mass spectrometry were used to determine the apoptosis-related proteins, Bcl-2 and Bax, and the content of copper in serum and tissue, respectively. ResultsCompared with the control group, the TX mice had significantly lower expression of Bcl-2 in brain tissue (P<0.05) and serum content of copper (P<0.05), as well as significantly higher expression of Bax (P<0.05) and content of copper in brain tissue (P<0.05). The multiple stepwise regression analysis showed that Rhizoma Curcumae Longae and Rheum officinale were influencing factors for the content of copper in serum and brain tissue, respectively; Coptis chinensis and Alisma orientalis were both influencing factors for the expression of Bax and Bcl-2 in brain tissue; Rhizoma Curcumae Longae and Lysimachia christinae were influencing factors for the Bax/Bcl-2 ratio in nerve cells; there was no relationship of Radix Notoginseng with the above indices. ConclusionRheum officinale, Rhizoma Curcumae Longae, Coptis chinensis, Alisma orientalis, and Lysimachia christinae in Gandou Decoction synergize to protect nerve cells in the TX mice by targeting multiple pathways; Radix Notoginseng has no substantial contribution to protection of nerve cells in TX mice.

[Key words]uniform design; Gandou Decoction; effective traditional Chinese medicine component; compatibility