赖丽琼，冼文川，陈煜森

NINJ2基因5'上游单核苷酸多态性与脑梗死的相关性①

赖丽琼1，冼文川2，陈煜森2

目的分析粤西地区汉族人群NINJ2基因5'上游rs11833579G/A、rs4980959C/A单核苷酸多态性(SNPs)与脑梗死及亚型的关联性。方法采用联合聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)和直接测序方法，对278例脑梗死患者(病例组)和120例正常人(对照组)进行rs11833579G/A和rs4980959C/A多态位点基因型检测并进行关联分析。结果病例组rs11833579G/A与rs4980959C/A基因型频率和等位基因频率与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。小动脉闭塞型卒中rs4980959C/A位点AA基因型频率高于对照组(18.3%vs 9.2%,P=0.041)，A等位基因频率高于对照组(35.4%vs 46.1%,P=0.019)。多元Logistic回归分析结果显示，rs4980959C/A位点含AA基因型发生小动脉闭塞型脑梗死的可能性高于G等位基因携带者(OR=4.012,95%CI:1.209～14.939，P= 0.027)。结论NINJ2基因5'上游非编码区SNPrs11833579G/A多态性与缺血性脑卒中无关；SNPrs4980959C/A的A等位基因是小动脉闭塞型脑梗死的危险因素；AA基因型是小动脉闭塞型的易感基因型。

NINJ2基因；脑梗死；单核苷酸多态性

[本文著录格式]赖丽琼，冼文川，陈煜森.NINJ2基因5'上游单核苷酸多态性与脑梗死的相关性[J].中国康复理论与实践, 2015,21(3):315-319.

CITEDAS:Lai LQ,Xian WC,Chen YS.Association of NINJ2 gene 5'upstream single-nucleotide polymorphisms with cerebral infarction[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(3):315-319.

脑梗死是一种复杂的多因素疾病。动脉粥样硬化、高血压、高血脂、糖尿病等均是脑梗死的高危因素。全基因组关联研究(Genome-wide Association Study,GWAS)发现，诸多染色体变异和脑梗死有关联[1]；有研究提示，位于染色体12p13上NINJ2基因的单核苷酸多态位点(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)与脑梗死有关，但国内外研究结论并不一致[2-4]。我们推测，该相关性与人群及脑梗死的各亚型

有关。本研究拟通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法结合直接测序方法分析NINJ2基因5'上游非编码区rs11833579G/A和rs4980959C/A两多态位点在粤西地区汉族人中基因频率和频率，并探讨两个位点与粤西地区汉族人脑梗死及亚型的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例组为广东医学院附属医院2011年7月～2012年3月住院的患者，为粤西地区汉族人，共278例，均符合1995年全国第四次脑血管病学术会议制定的脑梗死标准[5]，并经头部CT和/或磁共振成像(MRI)确诊。对照组为同期在广东医学院附属医院健康体检者，为粤西地区汉族人，共120名，排除脑血管病、冠心病、糖尿病，肝、肾、血液、自身免疫性疾病。病例组和对照组均记录以下指标：年龄、性别、吸烟史、血压、糖尿病、空腹血糖、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)。

病例组按照TOAST标准，分为大动脉粥样硬化性卒中(large-artery atherosclerosis,LAA)、心源性脑栓塞(cardioembolism,CE)、小动脉闭塞性卒中或腔隙性卒中(small-artery occlusion,Lacunar,SAA)、其他原因所致的缺血性卒中(stroke of other determined etiology,SOE)和不明原因的缺血性卒中(stroke of other undetermined etiology,SUE)。因本组资料SOE和SUE样本量极少，予以剔除。

1.2 方法

1.2.1 相关多态性位点的筛选

rs11833579G/A为GWAS研究得出与缺血性脑卒中相关的位点[2]，rs4980959C/A通过SNPper软件从公共数据库获得。选择本实验的SNPs根据是否有合适的限制性内切酶、中国人群较小的等位基因频率大于10%，共选择2个多态位点：rs11833579G/A和rs4980959C/A，都位于NINJ2基因5'上游非编码区。

1.2.2 血样本的收集

抽取早晨空腹肘部静脉血2 ml至含有EDTA-K2的抗凝试管，提取外周血白细胞的基因组DNA，将提取后剩下的血标本-20℃保存。

1.2.3 血糖、血脂水平检测

利用全自动生化检测仪测定血糖、胆固醇、甘油三酯、HDL、LDL。

1.2.4 DNA的提取

用溶液法(TIANamp Blood DNA System，北京天根生化科技有限公司)按说明书提取外周血白细胞的基因组DNA，平均产量约为35 mg/L。

1.2.5 DNA扩增

PCR引物以引物设计软件PRIMER 5.0设计。

rs11833579G/A：上游5'-CCA GCA TTG TGG GAAGT-3'；下游5'-CCC TCTATT CAG CCAGAT-3'

rs4980959C/A：上游5'-GTC TCT GCT GTT TCT TCG-3'；下游：5'-GAT GCT GTC ACT ACC AAC TCA-3'

目的基因的PCR扩增方法如下。rs11833579G/ A：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，60.5℃退火30 s，72℃延伸60 s；30个循环后72℃延伸10 min。rs4980959C/A：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s；30个循环后72℃延伸10 min。

1.2.6 限制性内切酶设计

根据片段序列以及多态性位点，在NEBcutter V2.0(http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)设计限制性内切酶：rs11833579G/A内切酶为BtscI，rs4980959C/A内切酶为Hpy188I。

1.2.7 扩增产物酶切及基因型分析

rs11833579G/A扩增片段长度为404 bp。杂合子AG基因型经BtscI消化后产生3个片段，分别是404 bp、304 bp和100 bp；纯合子GG基因型可被BtscI完全消化，显示片段为304 bp和100 bp；纯合子AA基因型无BtscI酶切位点，显示为PCR产物的404 bp片段。

rs4980959C/A扩增片段长度为218 bp。杂合子AC基因型经Hpy188I消化后产生3个片段，分别是218 bp、150 bp和68 bp；纯合子CC基因型可被Hpy188I完全消化，显示片段为150 bp和100 bp；纯合子AA基因型无Hpy188I酶切位点，显示为PCR产物的218 bp片段。

1.3 统计学分析

应用SPSS 19.0统计软件和遗传学数理统计方法进行统计分析。各组临床计量资料均以(±s)，计算性别、吸烟、高血压病、糖尿病、颈动脉彩色多普勒超声检查结果、各组基因型和等位基因频率，Hardy-Weinburg平衡吻合度和基因频率统计分析采用χ2检验，计量资料采用t检验，各变量与脑梗死的关系采

用多元Logistic回归分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 rs11833579G/A

病例组rs11833579G/A基因型GG、GA、AA频率与对照组无显著性差异(P＞0.05)。病例组等位基因G、A频率与对照组无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

按性别及脑梗死亚型进行分析，无论男性或女性，该位点基因型与等位基因频率在脑梗死各亚型组与对照组间均无显著差异(P＞0.05)。见表2。

2.2 rs4980959C/A

病例组rs4980959C/A的基因型CC、CA、AA频率与对照组无显著性差异(P＞0.05)。病例组等位基因C、A频率与对照组无显著性差异(P＞0.05)。见表3。

按性别及脑梗死亚型进行分析，SAA组AA基因型频率高于对照组(P=0.041)，CC、CA基因型频率无显著性差异(P＞0.05)；A等位基因频率高于对照组(P= 0.019)。见表4。不论男性或女性，基因型与等位基因频率病例组各亚型与对照组之间均无显著性差异(P＞0.05)。见表5。

2.3 多元Logistic回归分析

以脑梗死为因变量，以性别、吸烟、高血压病、糖尿病、空腹血糖、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低高密度脂蛋白、半胱氨酸、病例组rs4980959C/ A基因型AA、小动脉闭塞型rs4980959C/A基因型AA为自变量进行多元Logistic回归分析，结果显示，脑梗死的危险因素有高血压病、空腹血糖、半胱氨酸、小动脉闭塞型rs4980959C/A基因型AA(P＜0.05)。见表6。

表1 rs11833579G/A多态性基因型频率及等位基因频率[n(%)]

表2 不同性别及脑梗死亚型间rs11833579G/A多态性基因型频率及等位基因频率[n(%)]

表3 rs4980959C/A多态性基因型频率及等位基因频率[n(%)]

表4 不同脑梗死亚型间rs4980959C/A多态性基因型频率及等位基因频率[n(%)]

表5 不同性别及脑梗死亚型间rs11833579G/A多态性基因型频率及等位基因频率[n(%)]

表6 人群中多元Logistic回归分析结果

3 讨论

NINJ2基因位于染色体12p13.33，包括4个外显子和3个内含子，编码由142个氨基酸组成的约20 kDa的蛋白质，即神经损伤诱导蛋白2(ninjurin 2)[6]。Ninjurin 2是ninjurin家族的一员，初步研究提示ninjurin 2可表达于神经系统，在周围神经系统可介导同种细胞相互作用，以促进背根神经节神经元的轴突生长；周围神经损害可诱导施万细胞上调表达该蛋白，以促进神经突生长和神经再生[7]。在中枢神经系统内，ninjurin 2的表达程度可能影响脑对缺血的耐受性；动物研究发现，在损伤的脊髓中，NINJ2基因转录表达分析发现cDNA表达量明显改变，提示ninjurin 2的蛋白表达水平可能参与中枢神经系统缺血性损伤耐受机制[6,8]。NINJ2作为一个评价脑卒中预后的候选基因，可能能改变脑细胞对缺血损伤的反应[9]。

目前已知约95%的SNP位于非编码区。现有卒中GWAS研究提示，染色体12p13上NINJ2基因5'上游非编码区两个SNP与LAA型脑梗死显著关联，从而使得非编码区SNP得到更多关注[2]。

本研究中，rs11833579G/A位点的基因型与基因频率与粤西地区汉族人群缺血性脑卒中无关联，按性别及脑梗死亚型进行分层后，仍然提示两者之间无关联。Ikram的GWAS初筛研究提示，rs11833579G/A位点A等位基因增加白种人发生LAA型脑梗死的风险1.35倍[2]。Kim等认为，rs11833579 A/A或G/A基因型与韩国低龄患者(年龄＜59岁)的首次卒中有关[10]。国内陈廓的研究发现，该位点GG基因型和G等位基因与中国房山地区汉族人脑梗死呈强正相关[11]。Matsushita

等研究表明，在日本人中，rs11833579G/A与LAA型脑梗死及其他亚型均无相关性[12]。尚贤金等发现，rs11833579 G/A位点与福建地区汉族人LAA型脑梗死发病无关联[13]。

本研究对象rs11833579 G/A次要等位基因频率(minor allele frequency,MAF)为34.5%，白种人中MAF为23%[2]，与本研究有显著性差异(χ2=96.407,P＜0.05)；日本人MAF为42%[12]，与本研究同样存在显著性差异(χ2=10.682,P＜0.05)；福建地区人群MAF为36.4%，与本研究无显著性差异(χ2=1.574,P＞0.05)。相关研究结果不尽一致，可能与人群的遗传背景有关，如种族、地区等；同时样本量存在差异很大，可能对结果也有一定的影响[14]。

本研究中，rs4980959C/A位点的基因型与基因频率与粤西地区汉族人群缺血性脑卒中无关联。按脑梗死亚型分层，SAA组rs4980959C/A位点AA基因型频率高于对照组，A等位基因频率高于对照组。位点rs4980959C/A曾报道其基因与基因型与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)无相关性，但rs4980959C/A参与的单倍体型CAGGA可降低AD的患病风险[15]。目前国内外尚未见有关位点rs4980959C/A多态性与脑梗死关联的报道。

经多元Logistic回归分析，校正了吸烟、血压、血糖、血脂等传统危险因素的影响后，AA基因型发生SAA型脑梗死的风险是普通人群的4.012倍。因此，我们推测，NINJ2基因5'上游非编码区rs4980959C/A可能通过参与基因调控影响NINJ2基因的功能，具体机制还不清楚。

此次我们未进行人体内ninjurin 2蛋白水平的测定，不能对该基因的功能进行分析。需要进一步研究探索。

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Association of NINJ2 Gene 5'Upstream Single-nucleotide Polymorphisms with Cerebral Infarction

LAI Li-qiong1,XIAN Wen-chuan2,CHEN Yu-sen2
1.Department of Neurology,Xiangdong Hospital,Hunan Normal University,Liling,Hunan 412200,China;2.Department of Neurology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang,Guangdong 524001,China

Objective To investigate the relationship between cerebral infarction(CI)and the single-nucleotide polymorphisms(SNPs) of rs11833579G/A and rs4980959C/A of NINJ2 gene in Han population of the Western Guangdong province in China.Methods Genotype and allele frequency of rs11833579G/A and rs4980959C/A were analyzed in 278 cerebral infarction patients and 120 healthy controls.Results There was insignificant difference in frequencies of genotypes and allele in two polymorphisms(rs11833579 G/A and rs4980959C/A) of NINJ2 gene between CI and control groups(P＞0.05).AAgenotype frequency of rs4980959C/Awas more in patients with small-artery occlusion(SAA)than in the control group(18.3%vs 9.2%,P=0.041),while the A allele frequency was more in the patients with SAA than in the control group(35.4%vs 46.1%,P=0.019).Logistic regression analysis indicated that AA genotypes of rs4980959C/A was a risk factor for SAA over G allele carriers(OR=4.012,95%CI:1.209～14.939,P=0.027).Conclusion NINJ2 gene 5'upstream untranslated region SNPrs11833579G/A polymorphism does not associate with the risk of ischemic stroke.NINJ2 gene 5'upstream untranslated region SNPrs4980959C/AAallele is a risk factor for SAA,AAgenotype is a susceptible genotype for SAA.

NINJ2 gene;cerebral infarction;single-nucleotide polymorphisms

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.03.017

R743.3

A

1006-9771(2015)03-0315-05

2014-10-09

2014-11-17)

广东医学院青年基金项目(No.XQ1016)。

1.湖南师范大学附属湘东医院神经内科，湖南醴陵市412200；2.广东医学院附属医院神经内科，广东湛江市524001。作者简介：赖丽琼(1983-)，女，汉族，湖南株洲市人，硕士，医师，主要研究方向：脑血管病。通讯作者：陈煜森，男，主任医师，主要研究方向：脑血管病及神经系统变性疾病。E-mail:chenyusen925@163.com。