吕凯露，夏有兵,，程洁，穆艳云，朱冰梅，罗玺，梁莎，庄克清

刺血疗法对急性痛风性关节炎大鼠局部抗炎因子的影响①

吕凯露1，夏有兵1,2，程洁1，穆艳云1，朱冰梅1，罗玺2，梁莎3，庄克清1

目的探讨刺血疗法治疗急性痛风性关节炎的相关抗炎分子机制。方法60只Sprague-Dawley大鼠等分为正常组、正常刺血组、假手术组、模型组、刺血组、药物组。右踝关节腔注射尿酸钠建立急性痛风性关节炎大鼠模型。药物组以布洛芬灌胃治疗，正常刺血组和刺血组在右侧昆仑穴点刺放血。治疗前后测量各组大鼠踝关节周径。用RT-PCR法和Western blotting法检测大鼠踝关节白细胞介素(IL)-10、IL-4 mRNA和蛋白表达。结果治疗后刺血组较正常组踝关节周径增大(P＜0.05)，较模型组、药物组周径减小(P＜0.05)。刺血组较正常组、模型组、药物组踝关节IL-10 mRNA的相对表达量升高(P＜0.05)，较正常组、模型组IL-10蛋白表达增加(P＜0.05)；刺血组踝关节IL-4 mRNA和蛋白表达较正常组有升高趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。结论刺血疗法通过促进局部IL-10表达发挥抗炎作用，可能是其治疗急性痛风性关节炎的作用机制之一。

急性痛风性关节炎；刺血疗法；白细胞介素-10；白细胞介素-4；炎症

[本文著录格式]吕凯露，夏有兵，程洁，等.刺血疗法对急性痛风性关节炎大鼠局部抗炎因子的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21(3):276-279.

CITED AS:Lü KL,Xia YB,Cheng J,et al.Effects of pricking bloodletting therapy on local anti-inflammatory cytokine in rats with acute gouty arthritis on ankle[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(3):276-279.

痛风性关节炎是一种由关节内尿酸结晶介导的炎症性关节炎，多与高尿酸血症有关，易反复发作，若得不到有效治疗，极易致残、致畸，影响关节功能[1-2]。现有治疗皆有不同程度的副反应[3-4]。近年临床报道，刺血疗法治疗急性痛风性关节炎起效快、疗效佳、副作用少[5-8]。我们以往实验研究结果也证实，刺

血疗法能有效快速地减轻关节腔尿酸钠的沉积，减少炎细胞的浸润，改善关节软骨的超微结构，改善局部症状及功能活动[9]。有研究表明，急性痛风性关节炎的发生与其局部促炎和抗炎细胞因子的失衡有关[10]。本研究运用刺血疗法治疗急性痛风性关节炎大鼠[11]，观察关节内抗炎因子白介素10(interleukin-10, IL-10)、白介素4(interleukin-4,IL-4)的mRNA和蛋白表达变化，探讨刺血疗法治疗急性痛风性关节炎的相关抗炎分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康SPF级Sprague-Dawley大鼠60只，雄性，体重(200±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)2012-0001。每笼5只合笼饲养于南京中医药大学SPF级实验动物中心，室温22～25℃，12/12 h昼夜节律，自由进食与饮水，适应性饲养1周。将大鼠编号，用随机数字表法分为正常组(N组)、正常刺血组(BN组)、假手术组(S组)、模型组(UA组)、刺血组(B组)、药物组(I组)，每组10只。实验过程中对动物的处置遵循相关动物伦理学要求。

1.2 主要试剂及仪器

尿酸钠：SIGMA公司。布洛芬混悬液：江苏恒瑞医药股份有限公司。IL-10抗体、IL-4抗体、β-actin抗体：ABCAM公司。HRP标记的羊抗兔二抗：CST公司。化学发光底物、SYBR Green：THERMO公司。Trizol试剂：INVITROGEN公司。第一链cDNA合成试剂盒：ROCHE公司。IL-10基因引物、IL-4基因引物、GAPDH基因引物：上海捷瑞生物工程有限公司。

MIKRO220/220R低温高速离心机：HETTICH公司。紫外分光光度仪：JENWAY公司。垂直电泳仪，垂直、转印电泳槽：BIO-RAD公司。化学发光成像仪：上海BIOSHINE公司。Nano微量分光光度计、分子杂交PCR仪：THERMO公司。Mx3000P实时荧光定量PCR仪：STRATAGENE公司。

1.3 造模方法

称取尿酸钠0.2 g，充分研磨，加入无菌生理盐水4 ml，制成5%尿酸钠混悬液备用。大鼠10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉。N组、BN组不手术；UA组、B组、I组大鼠将右后肢踝关节摆放成直角，充分暴露踝关节与胫腓骨之间的间隙，75%酒精局部皮肤消毒，4号针头以45°角从该间隙插入右后肢背侧正中踝关节与胫腓骨之间的关节腔，注入5%尿酸钠溶液50 μl。大鼠右后肢踝关节肿胀，关节活动受限，提示造模成功。S组注入生理盐水50 μl。

1.4 干预方法

B组于造模后6 h、24 h固定患肢，在右侧昆仑穴(后肢外踝与跟腱之间的凹陷中)[12]用0.7 mm注射器针头点刺放血，深度约0.3 cm，以污血放尽为度；BN组以与B组相同的方式点刺放血，以自然停止出血为度；N组于麻醉后6 h、24 h固定右后肢5 min；S组、UA组分别于造模后6 h、24 h固定患肢5 min；I组于造模后6 h、24 h予布洛芬120 mg/kg灌胃。

1.5 标本采集

造模后48 h，颈椎脱臼法处死大鼠，迅速打开大鼠右后肢胫跗关节，以眼科剪剪切软骨及周围肌肉组织，10%PBS快速洗涤，冻存于1.5 ml冻存管内，保存于-80℃冰箱备用。

1.6 检测方法

1.6.1 踝关节周径测量

各组在造模后6 h(治疗前)、48 h(治疗后)分别用长2～3 mm的纸条测量造模踝关节周径，每个时间点重复测量3次，取平均值[13]。

1.6.2 踝关节IL-10、IL-4 mRNA表达

组织用液氮磨碎后，Trizol试剂提取总RNA，氯仿和异丙醇抽提。微量分光光度计和琼脂糖电泳鉴定RNA浓度和纯度，根据逆转录试剂盒说明反转录合成cDNA，-20℃冻存备用。取cDNA 2 μl行PCR扩增反应，以GAPDH作为内参。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。循环40次。用自带软件系统得出相对应的Ct值，计算每个样本的△Ct，以及样本的△Ct值和样本所在组的△Ct均值之差(△△Ct)，△△Ct进行乘幂运算得到Fold change值作为目的基因的mRNA相对表达量。具体序列及扩增长度如下。

IL-10：上游CCT CTG GAT ACA GCT GCG AC；下游AGTAGATGC CGG GTG GTT CA；长201 bp。

IL-4：上游CTT GCT GTC ACC CTG TTC TGC TT；下游TTC TCC GTG GTG TTC CTT GTT G；长176 bp。

GAPDH：上游GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G；下游ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA；长143 bp。

1.6.3 踝关节IL-10、IL-4蛋白表达

组织用液氮磨碎，加入裂解液匀浆，低温高速离心机4℃、10000 r/min离心5 min，上清液为总蛋白提取物。用BCA法测定蛋白浓度。将每份蛋白定量为30 μg，上样20 μl，70/130 V电泳约2 h，转膜液中以300 mA 2 h电转移至PVDF膜上；取下PVDF膜，PBST洗膜，置5%BSA中室温封闭1.5 h；选择相应的大小范围的条带加一抗(1∶3000)中，4℃摇床过夜；PBST洗膜后加二抗(1∶6000)，室温摇床缓慢摇动2 h；PBST洗膜，化学发光底物发光，化学发光成像系统采集图像，相应软件分析系统测定目的蛋白和内参蛋白条带灰度值，以目的蛋白灰度值/内参灰度值的比值作为该蛋白表达水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 踝关节周径

和N组比较，S组和BN组踝关节周径未见增大(P＞0.05)。而治疗前后UA组、B组、I组踝关节周径均增大(P＜0.05)。和UA组比较，治疗后B组、I组踝关节周径减少(P＜0.05)，且B组小于I组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组踝关节周径的比较(mm)

2.2 踝关节IL-10、IL-4 mRNA表达

B组IL-10 mRNA相对表达量较N组、UA组、I组升高(P＜0.05)。各组踝关节IL-4 mRNA相对表达量无显著性差异(P＞0.05)，但两两比较时，UA组踝关节IL-4 mRNA相对表达量较N组、BN组、I组升高(P＜0.05)。见表2。

2.3 踝关节IL-10、IL-4蛋白表达

N组、BN组和S组踝关节IL-10、IL-4蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。UA组、B组、I组踝关节IL-10蛋白升高(P＜0.05)，B组高于UA组(P＜0.05)。UA组、I组踝关节IL-4蛋白表达较N组升高(P＜0.05)，UA组还较BN组、S组升高(P＜0.05)。见表3。

表2 各组踝关节IL-10、IL-4 mRNA表达比较(2△△Ct)

表3 各组踝关节IL-10、IL-4蛋白表达比较

3 讨论

急性痛风性关节炎是尿酸钠沉积后引起的关节软骨破坏、滑膜产生炎症反应，表现为关节红肿热痛[14]。中医认为，急性痛风性关节炎的发病关键是血中瘀热。刺血疗法遵循“血有余，则泻其盛经出其血”的原则，具有清热、止痛、消肿、祛瘀的治疗作用。

IL-10作为一种抗炎细胞因子，主要生理功能为抑制中性粒细胞[15]。Murakami等认为，IL-10过表达可能会对尿酸钠结晶诱导的急性炎症起抗炎效果[16]。IL-10主要通过抑制炎性细胞因子、趋化因子和花生四烯酸代谢产物的产生，发挥抗炎作用。Verhoef等认为，IL-10可促使Th1细胞转化为Th2细胞，亦可提高Ⅰ型胶原蛋白的合成水平，对关节软骨有保护和修复

作用[17]。

本研究显示，刺血治疗后，急性痛风性关节炎大鼠局部关节IL-10的mRNA和蛋白表达量明显高于正常组和模型组，发挥抗炎作用。

IL-4是由Th2细胞和肥大细胞分泌的抗炎因子，能抑制IL-1、IL-6、IL-8等炎性细胞因子合成，并能在mRNA水平上阻断单核细胞、CD4+或CD8+T细胞[18]。本研究显示，刺血组踝关节IL-4虽有升高的趋势，但无显著性。文献报道，在其他关节炎治疗中，IL-4局部抗炎作用的发挥多需治疗5 d或以上[19-21]。我们推测B组IL-4表达不高与作用时间不足(48 h)有关。有待进一步研究。

我们以往研究证实，刺血疗法清热、祛瘀、消肿、止痛的作用适用于急性炎症反应。本研究显示，刺血疗法的清热、祛瘀、消肿、止痛作用可能是通过上调抗炎因子IL-10的表达实现的。

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Effects of Pricking Bloodletting Therapy on Local Anti-inflammatory Cytokine in Rats with Acute Gouty Arthritis onAnkle

LÜ Kai-lu1,XIA You-bing1,2,CHENG Jie1,MU Yan-yun1,ZHU Bing-mei1,LUO Xi2,LIANG Sha3,ZHUANG Ke-qing1
1.Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu 210023,China;2.Nanjing Medical University,Nanjing,Jiangsu 210029,China;3.Hunan University of Medicine,Huaihua,Hunan 418000

Objective To explore the anti-inflammatory of pricking blood therapy in acute gouty arthritis rats.Methods 60 Sprague-Dawley rats were equally divided into normal group,bloodletting normal group,sham group,arthritis group,bloodletting group and ibuprofen group.The acute gouty arthritis model was established with injecting uric acid sodium salt into the right ankle joint cavity. The ibuprofen group was administrated with ibuprofen intragastrically,the bloodletting normal group and bloodletting group were pricked the right Kunlun(BL60)acupoint.The cross section diameter of the right ankle joint were measured before and after treatment.Levels of mRNA and protein of interleukin(IL)-10 and IL-4 expressed in ankle were determined with RT-PCR and Western blotting Results The cross section diameter increased in the bloodletting group compared with the normal group after treatment(P＜0.05),and decreased(P＜0.05)compared with the arthritis group and the ibuprofen group,while the expression of IL-10 mRNA increased(P＜0.05)compared with the normal group,the arthritis group and the ibuprofen group,as well as the IL-10 protein compared with the normal group and the arthritis group(P＜0.05).The expression of IL-4 mRNA and protein increased without significance(P＞0.05)in the bloodletting group compared with the normal group.Conclusion IL-10 may play a role of anti-inflammatory in pricking bloodletting therapy for acute gouty arthritis.

acute gouty arthritis;pricking bloodletting therapy;interleukin-10;interleukin-4;inflammatory

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.03.008

R589.7

A

1006-9771(2015)03-0276-04

2014-12-16

2015-02-05)

国家自然科学基金资助项目(No.81273840)。

1.南京中医药大学，江苏南京市210023；2.南京医科大学，江苏南京市210029；3.湖南医药学院，湖南怀化市418000。作者简介：吕凯露(1991-)，女，汉族，浙江永康市人，硕士研究生，主要研究方向：针灸流派研究、刺血疗法的机制研究。通讯作者：夏有兵。E-mail: xyb@njmu.edu.cn。