张鹏飞，徐成成，李文磊，郭海英

电针对局灶性脑缺血大鼠10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白和神经生长相关蛋白-43表达的影响①

张鹏飞1，徐成成2，李文磊2，郭海英1

目的探讨电针对胡须体觉皮层局灶性脑缺血大鼠10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白(PTEN)和神经生长相关蛋白43(GAP-43)表达的影响。方法24只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为假手术组(n=8)、模型组(n=8)及电针组(n=8)。于造模成功后第3天，电针组予电针百会(DU20)和风府(DU16)30 min，每天1次。造模前1 d，给药后3 d、7 d和14 d，应用角落测试进行行为学检测；给药后14 d采用Western blotting检测梗死周边区PTEN、GAP-43蛋白的表达。结果电针组向右转的次数较模型组显著下降(P＜0.001)。模型组GAP-43表达较假手术组升高(P＜0.05)，电针组较模型组升高(P＜0.05)。模型组PTEN表达与假手术组无显著性差异(P=0.460)，电针组较模型组显著降低(P＜0.001)。结论电针可能通过抑制PTEN和增加GAP-43的表达促进脑缺血后神经再生和功能恢复。

脑缺血；电针；神经再生；10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白；生长相关蛋白-43；大鼠

[本文著录格式]张鹏飞，徐成成，李文磊，等.电针对局灶性脑缺血大鼠10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白和神经生长相关蛋白-43表达的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21(1):35-38.

CITED AS:Zhang PF,Xu CC,Li WL,et al.Effects of electroacupuncture on expressions of phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten and growth associated protein 43 in rats with barrel cortex ischemia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21 (1):35-38.

缺血性脑血管疾病是严重威胁人类健康的重要疾病，是导致死亡和残疾的主要原因，但是治疗方法相当有限，其最有效的治疗方法就是发病3～6 h内急性溶栓治疗。然而由于各种原因的限制，只有近1%的患者能够进行有效溶栓治疗[1-2]。目前认为，促进神经组织再生修复是脑缺血后唯一长期有效的治疗方法。

针灸广泛应用于脑卒中的治疗，临床疗效肯定，对脑卒中引起的功能损伤，如偏瘫、吞咽困难、失语、尿失禁和抑郁等的治疗中疗效显著[3-7]，但其作用机制尚不清楚。10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)基因作为一种肿瘤抑制基因，近年来发现其在神经发生和再生过程中起重要作用，是神经系统发育成熟过程中轴突生长和再生能力逐渐下降的一个非常重要的内在控制分子，抑制PTEN能明显促进成熟神经系统再生修复[8]。神经生长相关蛋白-43( growth associated protein 43,GAP-43)是一种胞膜磷酸蛋白质，是一种神经特异性的蛋白质，广泛存在于神经组织中，在生长、分化和再生的轴突末端以及突触前膜含量极高，主要参与神经细胞外生长及突触发育形成和神经细胞再生[9-11]。

本实验通过观察电针对胡须体觉皮层局灶性脑缺血大鼠胡须功能的恢复以及脑梗死周边区组织PTEN和GAP-43蛋白的表达情况，探究电针对脑缺血后神经再生修复的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠24只，体质量(200±20)g，由江苏省中医院药理实验室提供。实验前适应性饲养1周，标准化环境饲养。

G6805电针仪：上海华谊医用仪器有限公司。DYY-7C型电泳仪：北京市六一仪器厂。TY-80S型脱色摇床：普阳科学仪器研究所。KDC-140HR型高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。立式高压灭菌器：上海博迅实业有限公司。电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。BioSpectrum凝胶成像系统：美国UVP公司。分光光度计：德国EPPENDORF公司；荧光激发滤过成像系统(LSM-GB200激光共聚焦显微镜、Dage-CCD-72摄像机)：日本Olympus。PeriFlux System 5000-PF5010 LDPMunit激光多普勒脑血流仪：瑞典PERIMED公司。RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒：上海碧云天公司。se-2005羊抗鼠IgG-HRP、sc-2004羊抗兔IgG-HRP：SANTA CRUZ公司。鼠β-Actin单克隆抗体、兔PTEN单克隆抗体、兔GAP-43单克隆抗体：CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模

参照文献[12]建立胡须体觉皮层局灶性脑缺血模型。大鼠10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，左侧卧位固定于手术台上。显微镜下靠近眶后切开右颞侧皮肤及颞肌，钝性分离肌肉组织，暴露右侧颞骨。手术电钻在前囟水平距中线右侧4.1 mm处(ML+4.1 mm)开一个3～4 mm的颅骨窗，保持硬脑膜完整。刺激对侧胡须，应用荧光激发滤过成像系统检测内在光信号(IOS)、激光多普勒脑血流仪测定刺激前后局部脑血流，确定胡须体觉皮质。11.0手术线穿过硬脑膜，结扎胡须体觉皮质周围2～3支大脑中动脉分支，同时结扎双侧颈总动脉10 min，局部血管成像信号消失，刺激对侧胡须，血管信号无反应，说明选择并结扎了正确的血管，造模成功。缝合皮肤。

3 d后将造模大鼠分为电针组8只与模型组8只。假手术组8只大鼠处理过程同造模大鼠，但不结扎大脑中动脉分支。

1.2.2 电针

自制大鼠固定器，在不麻醉、清醒状态下固定大鼠，尽量不妨碍大鼠的生理活动。大鼠电针穴位定位参考文献[13]，取百会(DU20)、风府穴(DU16)。电针组大鼠俯卧位固定，“华佗牌”不锈钢针直径0.30 mm，长25 mm，常规消毒，斜刺9～10 mm，接G6805电针仪，施以连续波，强度以针柄轻度抖动为度，每天1次，每次30 min，共14 d。模型组只捆绑固定，不电针。

1.3 行为学检测

采用角落测试(Corner Test)[14]，分别于造模前1 d，给药后3 d、7 d和14 d进行行为学检测。将大鼠放入一端封闭，由两块30×20×1 cm平板构成的30°夹角(corner)内，将一块底边长16 cm，腰长30 cm的等腰三角形板覆盖于夹角上，在夹角上半部留15×1 cm缝隙。当大鼠进入夹角深部，双侧的触须将受到刺激，大鼠将站立转身或贴地转身(头部从腹部下方钻过的屈曲转身)面向夹角开口端。每只大鼠做10次，计算左转、右转次数。正常大鼠向左向右转身的次数基本相等，右侧脑缺血大鼠向右侧(病灶侧)转身的次数明显增加。

1.4 Western blotting检测

给药后14 d，断头处死大鼠并取出梗死区周边脑组织。提取组织蛋白，应用Eppendorf分光光度计测

出样品中浓度。0.01 mol/L PBS(pH=7.4)稀释所有样品至4 μg/μl。SDS-PAGE凝胶电泳，转PVDF，放入封闭缓冲液中室温封闭1 h。分别进行一抗及二抗孵育：一抗在-4℃冰箱中摇床过夜，取出后用TBST摇床清洗6次，每次10 min；之后加入二抗，在37℃孵育箱内孵育2 h。按试剂盒要求配制化学发光试剂，滴加在膜上，经凝胶成像系统扫描并分析目的蛋白的表达。应用Image J软件进行灰度测定。以β-actin为内参，计算目的蛋白与β-actin比。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件处理实验数据。计量资料以(¯±s)表示，采用单因素方差分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 行为学检测

假手术组和造模各组造模前1 d向左、向右贴地转身概率接近。术后3 d，电针组与模型组向右侧转身次数较假手术组明显增多(P＜0.001)。术后7 d，电针组与模型组右转次数较3 d有所下降，电针组与模型组比较无显著差异(P=0.083)。术后14 d，电针组右转次数较模型组显著下降(P＜0.001)，接近假手术组水平(P=0.038)。假手术组大鼠不论何时向左、向右转的概率均接近。见表1。

表1 各时间点各组右转次数比较

2.2 Western blotting检测

模型组GAP-43表达较假手术组升高(P＜0.05)，电针组GAP-43表达较模型组及假手术组均升高(P＜0.05)。模型组PTEN表达较假手术组无显著性差异(P=0.460)，电针组PTEN表达较模型组及假手术组均显著降低(P＜0.001)。见表2。

表2 PTEN与GAP-43蛋白表达情况(/β-actin)

3 讨论

缺血性脑卒中发生后，大量神经细胞死亡和凋亡，相应神经元的突触联系中断；若要恢复其功能，必须恢复其突触联系。电针在功能缺损的康复方面效果显著。有研究显示，电针可以使缺血性脑卒中大鼠神经GAP表达增多、提高脑源性神经营养因子的表达等[15-16]，从而对受损的神经元轴突起到保护以及促进再生作用。

本研究选用的百会穴(DU20)与风府穴(DU16)均为督脉穴位，有醒脑开窍，填髓益脑，宁神定志的作用。督脉总督一身之阳，与诸阳脉相连，有“阳脉之海”之称。针刺督脉可以疏通阳经经气，培补真阳。督脉循行与脊里，入络于脑，与脑的关系极为密切，对大脑功能的调节起着重要作用。

PTEN是近年来新发现的同时具有脂质和蛋白质双重磷酸酶活性的肿瘤抑制基因。PTEN通过其脂质磷酸酶活性作用于磷脂酰肌醇3激酶(phosphotidylinositol 3-kinase,PI3K)的下游靶分子三磷酸肌醇酯(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3)，从而阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路。研究发现，PTEN在神经系统表达广泛，不仅参与神经系统正常功能的调节，而且在神经的发生和神经再生过程中也发挥重要作用。Park等在视神经损伤模型中，首次应用活体内条件性基因敲除PTEN，通过重新激活Akt/mTOR/S6K通路而实现视神经显著再生[8]。

本研究显示，电针可以抑制半暗区PTEN蛋白表达，对神经再生有一定促进作用。同时行为学测试在一定程度上也说明电针可改善大鼠的体感-运动功能。

GAP-43在神经元发育和再生过程中高水平表

达，是一种重要的神经生长和再生的分子标志物[17-19]。它主要通过聚集f-肌动蛋白，将生长锥附着、固定，使细胞变形，以利于生长锥延伸，从而促进轴突生长。本研究显示，电针在一定程度促进大鼠梗死区周围GAP-43表达，可能会促进神经元轴突的生长及再生，对受损神经有一定恢复作用。

综上所述，行为学检测与组织学研究结果均表明，电针百会和风府可以促进大鼠胡须功能的恢复，其作用机制可能是抑制梗死灶周边区PTEN表达、上调GAP-43表达，从而促进神经突触再生。

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Effects of Electroacupuncture on Expressions of Phosphatase and Tensin homology Deleted on Chromosome Ten and Growth Associated Protein 43 in Rats with Barrel Cortex Ischemia

ZHANG Peng-fei,XU Cheng-cheng,LI Wen-lei,GUO Hai-ying.Nanjing University of Traditional Chinses Medicine,Nanjing,Jiangsu 210029,China

Objective To investigate the effects of electroacupuncture(EA)on expression of phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten(PTEN)protein and growth associated protein-43(GAP-43)in rats with Barrel cortex focal ischemia.Methods 24 adult male Sprague-Dawley rats were divided into sham group(n=8),model group(n=8)and EA group(n=8).The EA group accepted EA at Baihui(DU20)and Fengfu(DU16)acupoints 3 days after modeling,30 min a time,once a day.They were assessed with Corner Test 1 day before modeling,and 3 days,7 days and 14 days after medication.The expression of GAP-43 and PTEN around infarct zone were detect with Western blotting 14 days after medication.Results The frequence of turn-right decreased in the EA group compared with that in the model group(P＜0.001)14 days after modeling.The expression of GAP-43 increased in the model group compared with that in the sham group(P＜0.05),and increased more in the EA group than in the model group(P＜0.05).There was no significantly difference in PTEN expression between the model group and the sham group(P=0.460),and significantly decreased in the EA group(P＜0.001).Conclusion EA may inhibit expression of PTEN protein and increase expression of GAP-43,which may be involved in nerve regeneration and functional recovery.

cerebral ischemia;electroacupuncture;nerve regeneration;phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten; growth associated protein 43;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.009

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0035-04

2014-10-09

2014-12-26)

国家自然科学基金项目(No.81100907)。

1.南京中医药大学，江苏南京市210029；2.南京中医药大学附属医院江苏省中医院神经内科，江苏南京市210029。作者简介：张鹏飞(1987-)，男，汉族，内蒙古赤峰市人，硕士研究生，主要研究方向：脑血管疾病的中医康复治疗。通讯作者：李文磊，女，博士，主治医师；郭海英，女，博士生导师，教授。E-mail:liwenlei80@163.com；ghying63@126.com。