李志强,何　德,李翠新

(西南林业大学 生命科学学院，云南 昆明 650224)



基于兼并引物的PCR扩增特定基因的效果比较

李志强,何德,李翠新*

(西南林业大学 生命科学学院，云南 昆明 650224)

摘要：根据NCBI上的DNA拓扑异构酶Ⅱ基因序列设计兼并引物，采用常规PCR、降落PCR、巢式PCR三种方法扩增糙皮侧耳和阿魏侧耳的拓扑异构酶Ⅱ部分基因序列，比较三种方法扩增效果的特异性、灵敏度.结果表明，巢式PCR的灵敏度和特异性都优于常规PCR和降落PCR，并且巢式PCR的灵敏度是常规PCR灵敏度的100倍以上，更加适合兼并引物扩增.这对利用兼并引物获取特异基因具有指导意义.

关键词：兼并引物；常规PCR；降落PCR；巢式PCR

表1　供试菌种名称及来源

20世纪90年代后，随着分生物学技术快速发展，PCR方法也得到广泛的应用.目前，常用的PCR技术有常规PCR、降落PCR、巢式PCR、免疫捕获PCR、荧光定量PCR、Long-PCR等一系列PCR方法.降落PCR(Touchdown PCR)技术是Don等[1]1991年提出的，它是将退火温度在多次循环中逐步降低的PCR技术，能够很好的弥补兼并引物最佳退火温度难以确定的缺点.巢式PCR在分子生物学中已经得到广泛的应用[2-4]，它是在普通基PCR础上发展起来的一项PCR技术，它的基本原理是通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性DNA片段，第二对引物的功能是特异性扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段.

DNA拓扑异构酶Ⅱ是真核生物代谢过程中重要的核酶，能够让一条完整的双链DNA穿过它的活性区域缺口后，完成双链DNA的解旋[5].本试验基于RT-PCR基本原理，利用设计的兼并引物，采用常规PCR、降落PCR以及巢式PCR方法对侧耳属(Pleurotus)DNA拓扑异构酶Ⅱ序列进行了PCR扩增，并比较三者之间的特异性及灵敏度，以期为利用兼并引物进行基因扩增和获取提供依据.

1　材料与方法

1.1试验材料

供试菌株为侧耳属的2个种，菌株来源及名称见表1.

1.2试验方法

1.2.1引物的设计与合成搜索并获取GenBank已经发表的11种侧耳属菌株的DNA拓扑异构酶Ⅱ基因序列(金顶侧耳，登录号为EU430628.1；哥伦比亚侧耳，登录号为EU430631.1；黑杏鲍菇，EU430633.1；菌核侧耳，EU430630.1；扇形侧耳，EU430639.1；桃红侧耳，EU430634.1；白灵菇，EU430636.1；盖囊侧耳，EU430637.1；红平菇，EU430638.1；鲍鱼菇，EU430625.1；黄白侧耳，EU430635.1)以及亚侧耳菌株(元蘑EU430627.1)和离褶伞属菌株(真姬离褶伞，EU430632.1)的拓扑异构酶Ⅱ部分基因序列.通过Clustal对齐后，经过Oligo6软件分析后根据保守序列设计两对简并引物.TOP1：GGCBAARTTCAAGGCYGAC；TOP2：CTCCAGCCHGTKCCRATR；TOP3：GATCATGACNGATCARGATCA；TOP4：GCGACYTTRATTTCCTTCT(引物由华大生物科技有限公司合成).

1.2.2总RNA提取总RNA提取采用TRIzon Reagent总RNA提取试剂盒(北京康为生物科技公司)，提取后的RNA电泳检测后放置于-80℃超低温冰箱保存备用.

1.2.3三种PCR反应特异性比较

1)cDNA第一链的获取

将提取到的总RNA2μL，用逆转录酶RevertAidTM H Minus(Fermantas 公司)1μL，oligodT(10mM) 2μL，总反应体系20μL反转录获得第一链cDNA.

2)常规PCR

取2μL已经获得的第一链cDNA模板2μL，用TOP1和TOP2，TOP 3和TOP 4(浓度均为10mM)各2μL分别进行2次常规PCR扩增.加入Taq MasterMix (北京康为生物科技)12.5μL，反应总体积都为25μL在PCR仪(BIO-RAD C1000 Thermal Cyclers)中进行常规PCR.TOP1和TOP2引物扩增循环参数为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s；72℃延伸30s，循环33次， 72℃终延伸5min.TOP3和TOP4扩增参数为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，33次循环；最后72℃终延伸5min.

3)降落PCR

降落PCR利用cDNA第一链作为模版，TOP3作为上游引物，TOP4作为下游引物，反应时退火温度从58℃每循环降低1℃，直至52℃后，再按照上面的常规PCR反应条件进行27轮循环.

4)巢式PCR

巢式PCR的第一轮扩增取cDNA2μL，上下游引物TOP 1和TOP 2各1μL，加Taq Mix 12.5μL补至25μL总反应体系.PCR循环参数为94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行33次循环.

对巢式PCR第一轮产物稀释50倍后取2μL做第二轮PCR模板，加入内侧引物TOP3和TOP4各2μL，进行25μL反应体系扩增，用上述常规PCR反应程序进行PCR扩增.

5)凝胶电泳检测

对上述三种PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳检测，将常规PCR中TOP3和TOP4扩增产物与降落PCR和巢式PCR进行产物特异性比较.

1.2.4三种PCR反应的灵敏度比较对反转录后的cDNA产物做10、102、103、104、105倍的浓度梯度稀释后取2μL作为常规PCR、降落PCR以及巢式PCR第一轮反应的模版，常规PCR运用TOP3和TOP4作为引物，运用上面三种PCR方法对其进行扩增，对目的产物进行凝胶电泳分析，比较其灵敏度.

1.2.5目的条带片段克隆检测对目的条带片段进行胶回收，将回收片段连接到PJET1.2/blunt vector(Fermantas 公司)上，然后转化至E.coliDH5α感受态细胞中，在含氨苄青霉素的LB平板培养基上筛选克隆菌落，挑选单克隆菌落，接种到含氨苄的LB液体培养基中，37℃振荡培养12h.将培养后菌液取20μL在沸水中煮沸10～15min，取1μL煮沸后的菌液做PCR反应的模版，进行菌液PCR.

菌液PCR采用PJET1.2通用引物各0.3μL，Taq MasterMix(康为生物科技)5μL，PCR水3.4μL，总反应体积10μL进行扩增.反应程序为：95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行25轮循环.

1.2.6测序和生物信息学分析将菌液PCR的产物取4μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定质粒载体中导入的片段大小是否与目的片段大小相同.将检测出的含有目的条带片段大小对应的菌液1mL送样进行序列测定(测序公司为华大科技有限公司).利用NCBI中的Blastp搜索软件对测序获得的序列进行分析鉴定.

注：M:marker； 1：糙皮侧耳；2：阿魏菇图1　总RNA提取电泳图Fig.1　Total RNA extraction from strains

注：M：DL2000marker； 1：糙皮侧耳； 2：阿魏菇图2　巢式PCR第一轮扩增结果Fig.2　The first round of reaction products by nested PCR

注：1，2，3道： 糙皮侧耳，5，6，7道：阿魏菇，4：阴性对照；1和5是常规PCR，2和6是降落PCR，3和7是巢式PCR图3　三种PCR方法扩增特异性比较Fig.3　The comparison of specificity of three methods

2　结果与分析

2.1总RNA提取结果检测

提取的总RNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1.总RNA条带清晰，泳道无背景弥散，5S条带较弱，28S条带与18S条带亮度接近2∶1.紫外分光光度计测定A260/A280的值介于1.8至2.0之间，说明RNA提取质量较高,适于RT-PCR实验.

2.2PCR特异性比较

由TOP1和TOP2引物进行的常规PCR扩增结果如图2所示.供试菌株糙皮侧耳和阿魏菇通过TOP1和TOP2引物进行PCR扩增得出的条带呈现弥散状，无相应的1400bp大小的目的条带，PCR结果特异性差.所以利用TOP1和TOP2引物对供试菌株进行PCR扩增无法获得特异性目的条带.

利用TOP3和TOP4引物进行常规PCR后与降落PCR和巢式PCR结果进行特异性比较，如图3所示.片段大小与目的片段大小一致为600bp左右，糙皮侧耳用三种PCR体系都可以成果扩增出特异性片段，阿魏菇只有降落PCR和巢式PCR有特异性条带，并且巢式PCR扩增后的条带要更加清晰.

图3中可以看出对于兼并引物来说巢式PCR的特异性要高于常规PCR和普通降落PCR，并且巢式PCR对于不同菌种的扩增效果稳定性更好.

2.3　常规PCR、降落PCR、巢式PCR的灵敏度检测

三种PCR反应灵敏度结果如图4所示.检测的条带大小为600bp为目的条带，常规PCR的灵敏度为10倍至102之间，降落PCR在模板稀释103后条带才变弱，而巢式PCR在模板稀释105后仍然能够检测出明显的条带.表明巢式PCR灵敏度能够达到普通PCR的100倍.

2.4　产物序列检测

对巢式PCR扩增产物进行克隆检测，挑取单克隆菌落进行菌落PCR，检测如图5.菌液PCR电泳检测条带为预期600bp大小.

将克隆后菌液进行测序获取核苷酸序列，在NCBI上BLAST搜索，结果显示Query coverage为40%～43%； Max ident值为94%～97%；E value值为0，搜索的结果击中的是DNA拓扑异构酶Ⅱ序列，且得分高的均为侧耳的DNA拓扑异构酶II，没有击中其他类型的基因序列，表明三种PCR扩增条带为所需的特异性目的条带.

3　结论与讨论

实验对三种PCR方法扩增侧耳属拓扑异构酶Ⅱ序列的特异性和灵敏度进行分析比较，得出常规PCR和降落PCR在通过兼并引物扩增目的序列时特异性和对属内不同菌种扩增的稳定性不能得到很好的保证，而巢式PCR的特异性效果明显.降落PCR在起始退火温度较高的时候能够特异性的扩增，即使退火温度最终降到非特异性杂交的Tm值时，但此时目的产物已经开始几何扩增，在剩余的循环中远远超过非特异性扩增产物量[6].王天云在利用改良的降落PCR方法扩增盐藻基因时，取得了不错的效果[7].本实验结果也证明了降落PCR在一定程度上可以提高PCR扩增的特异性与灵敏性，但是与巢式PCR的效果相比还存在一定差距.

在模板定量研究中发现巢式PCR在利用兼并引物扩增目的序列时灵敏度高于常规PCR和降落PCR并且是常规PCR灵敏度的100倍.虽然与李文杰[8]等检测的巢式PCR是常规PCR灵敏度1000倍的结果有差

注：M：DL2000marker；1～5：稀释倍数为10、102、103、104、105的常规PCR；6～10：稀释倍数为10、102、103、104、105的降落PCR；11-15：稀释倍数为10、102、103、104、105的巢式PCR图4　三种PCR的灵敏度检测Fig.4　The comparison of sensitivity of three methods

图5　菌液PCR检测Fig.5　The results of bacterial PCR

距，但是仍然可以证明巢式PCR具有高度灵敏性.其原因可能包括两方面：首先样本不同，本试验的检测对象为侧耳，李文杰的研究对象为克氏原螯虾.其次引物设计不同，本实验采用兼并引物而非特异引物，而李文杰则是在特异引物的基础上进行的研究.鹿连明等[9]对柑橘黄龙病菌的研究发现：针对同一基因，引物扩增特异性及灵敏度与扩增条带大小无关，但是PCR扩增的目的基因不同，其灵敏度也会存在差异.因此实验中的灵敏度检测存在差异也可能与实验目的基因有关.

试验中巢式PCR会存在一些极弱的非特异性条带，可能的原因是第一轮PCR扩增后会有残留的第一对引物，产生极弱的竞争性，对巢式PCR结果形成干扰.所以第一轮PCR加入的引物量同样很重要，并且第一轮PCR产物的浓度控制同样也很关键.

利用密码子的兼并性设计兼并引物扩增基因组DNA已经得到充分的利用.但是兼并引物存在特异性过低，易导致错配，引物利用率过低的局限性.建立一个适合兼并引物的PCR方法对目的基因进行扩增十分重要，实验结果表明巢式PCR非常适合利用兼并引物进行基因特异性扩增.

参考文献:

[1]Don R H,Cox P T,Wainwright B J,et al.Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification[J]. Nucleic Acids Research,1991,19(14):4008-4010.

[2]Ledwidge S A,Mallard B A,Gibson J P,et al.Multi-primer target PCR for rapid identification of bovine DRB3 alleles[J] Animal Genetics，2001,32(4):219-221.

[3]Navaneetham D,Penn A S, Howard J F Jr,et al.TCR～V beta usage in the thymus and blood of myasthenia gravis patients[J]. Journal of Autoimmunity,1998,11(6):621-633.

[4]Atzori C,Agostoni F,Angeli E,et al.Combined use of blood and oropharyngeal samples for noninvasive diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia using the polymemse chain reaction[J].European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases,1998,17(4):241-246.

[5]黄晨阳,李翠新,张金霞.基于DNA拓扑异构酶Ⅱ基因部分序列的侧耳属系统发育分析[J].植物遗传资源学报,2009,10(4):529-534.

[6]张贵星,袁保梅,许培荣.改良的降落PCR与普通PCR结果比较[J].郑州大学学报:医学版,2003,38(3):352-354.

[7]王天云,张贵星,薛乐勋.一种简便高效的改良降落PCR [J].中国生物工程杂志,2003,23(11):80-82.

[8]李文杰,周国勤,朱菲莉,等.检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的巢式PCR方法的建立与初步应用[J].南京师大学报,2009,32(2):98-102.

[9]鹿连明,胡秀荣,张利平,等.常规和巢式PCR对柑橘黄龙病菌的检测灵敏度比较[J].热带作物学报,2010,31(8):1280-1287.

责任编辑：高山

Comparison of Gene Amplification Effect under Three Methods

of PCR Based on Degenerate Primers

LI Zhiqiang,HE De,LI Cuixin*

(College of Life Sciences,Sothwest Forestry University,Kunming 650224,China)

Abstract：Three PCR methods(conventional PCR, touchdown PCR, nested PCR) were used to amplify the DNA topoisomeraseⅡ fragments of Pleurotus ostreatus and P.eryngii var ferulae with degenerate primers,which were designed with the gene sequences of DNA topoisomerase Ⅱ from NCBI. Their PCR sensitivity and specificity were compared. The result showed that the sensitivity and specificity of nested PCR were highest, and its sensitivity was 100 fold higher than conventional PCR, which indicated that the nested PCR was more suitable for PCR amplification under degenerate primers.This study will have some guidance significance to obtain the specific gene through degenerate primers.

Key words：degenerate primer; conventional PCR; touchdown PCR; nested PCR

DOI:10.13501/j.cnki.42-1569/n.2015.06.016

文章编号：1008-8423(2015)02-0174-05

通信作者：

作者简介：朱照武(1989- )，女，硕士生，主要从事林特食品加工与开发；*莫开菊(1965- )，女，博士，教授，主要从事食品加工及天然产物化学的研究.

基金项目：湖北省研究与开发计划项目(2010BBB016).

收稿日期：2015-05-19.

中图分类号：S182

文献标志码：A