王雪维(综述)，李　燕(审校)

(昆明医科大学第一附属医院眼科，昆明 650031)

Bcl-2、Bax在青光眼神经节细胞凋亡中的研究进展

王雪维△(综述)，李燕※(审校)

(昆明医科大学第一附属医院眼科，昆明 650031)

摘要：青光眼为人类三大致盲性眼病之一，视网膜神经节细胞凋亡在视神经损伤过程中扮演着重要角色，神经节细胞的凋亡途径及信号通路尚不完全清楚。Bcl-2家族是细胞凋亡调控的影响因子之一，参与青光眼视网膜神经节细胞的凋亡过程，Bcl-2/Bax的比例决定了神经节细胞是否走向死亡。该文就Bcl-2家族在青光眼神经节细胞凋亡过程中的作用机制及研究进展予以综述。

关键词：青光眼；Bcl-2/Bax；神经节细胞；细胞凋亡

青光眼是一组以视神经萎缩和视野缺损为特征的疾病，病理改变主要表现为视网膜神经节细胞的减少及神经轴突的丢失。以往研究认为，青光眼视神经损伤主要是由于眼内压升高，使轴浆阻滞于筛板区，轴突蛋白的生成和转运减少，神经节细胞丢失[1]。但近年研究发现，在正常眼压型青光眼、青光眼术后眼压控制良好的患者，即使眼压不高于正常，视野丢失也没有完全停止[2]。针对青光眼神经节细胞丢失机制的讨论还在继续，通过深入了解青光眼视神经损伤的机制，将为临床青光眼视神经保护药物的应用提供依据。细胞凋亡受多种相关基因及其蛋白调控，Bc1-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一[3]。现就Bcl-2/Bax与青光眼神经节细胞凋亡的机制及国内外研究进展综述如下。

1Bcl-2、Bax家族的结构及生物学功能

1.1Bcl-2结构及生物学功能抗凋亡蛋白 Bcl-2由239个氨基酸组成，相对分子质量为25 000～26 000，位于线粒体膜、内质网和核膜等处。Bcl-2基因位于 18q21，含有3个外显子和2个内含子，可编码26 000的Bcl-2α和22 000的Bcl-2β两种蛋白，其中Bcl-2α是抑制凋亡作用发挥的主要蛋白，也是线粒体膜的整合蛋白[4]。拓扑学结构显示，Bc1-2蛋白由7个 α螺旋紧密相连，2个疏水性长α螺旋组成发夹结构，其他5个α螺旋包围在其四周，中心α螺旋(α5和α6)垂直方向插入脂质双层膜参与离子通道形成，通过离子通道调节钙离子及蛋白质分子的流通量，这个三维结构是Bc1-2发挥抗凋亡作用的关键结构。研究发现，Bcl-2还可通过蛋白与蛋白之间的复杂热力作用进行调节[5]。

Bcl-2主要通过以下途径发挥抑制凋亡作用：①内质网上Bcl-2通过特殊的拓扑结构，控制离子通道开放，降低细胞质内Ca2+水平，实验证实通过转基因Bcl-2高表达可使Ca2+依赖性核酸内切酶活性降低，抑制Ca2+从内质网向胞质中的跨膜流动[6]。②Bcl-2可维持氧化还原状态及提高细胞的谷胱甘肽水平，线粒体上Bcl-2α蛋白为线粒体膜的整合蛋白，通过对抗线粒体巯基的氧化还原状态以控制其膜电位从而抑制细胞凋亡的发生[7]。Voehringer和Meyn[8]通过Bcl-2基因敲除的小鼠出现与暴露于慢性氧化应激中的小鼠一致的表现，认为Bcl-2在凋亡的起始阶段发挥了抗氧化作用。③Bcl-2蛋白通过阻止Bax/Bak的寡聚化，控制线粒体外膜通透转运孔孔道复合体的开放，抑制线粒体细胞色素 C和凋亡诱导因子等促凋亡因子的释放，抑制凋亡连锁反应。④Bcl-2通过与细胞凋亡蛋白(cell death abnormal，CED)9直接作用，可以抑制CED-3/CED-4复合体中CED-4的寡聚作用，从而阻止胱天蛋白酶2(caspase-2)活化，抑制线粒体细胞色素C的释放，从而起到抗凋亡作用[9-10]。

1.2Bax结构及生物学功能人类的Bax基因位于染色体19q13.3～13.4，由6个外显子和5个内含子组成，编码的Bax蛋白由192个氨基酸组成，相对分子质量约为21 000，由9个α螺旋组成，具有BHI、BH2和BH3三个结构域及C末端的跨膜结构域，在C-末端α9螺旋可介导异源二聚体的形成，通过疏水槽与Bcl-2蛋白结合，α螺旋结构是控制线粒体定位和二聚体形成的重要结构[11]。Bax蛋白是构成人B细胞和鼠淋巴干细胞的主要共沉淀蛋白，与 Bcl-2具有21%的同源性。Bax蛋白主要存在于细胞质内，细胞膜、细胞核也有表达，是一种跨膜蛋白。

Bax促凋亡的途径主要为以下两种：①通过特殊的BH3结构域识别线粒体膜上的Bcl-2蛋白，结合形成Bax-Bcl- 2异二聚体，抑制Bcl-2的抗凋亡作用；②细胞质内游离的Bax蛋白可直接在线粒体膜上形成Bax-Bax同源二聚体，改变线粒体膜的渗透性，激活caspase反应链，释放细胞色素C释放至胞质，启动细胞凋亡过程，引发细胞凋亡连锁反应。综上所述，Bax主要是通过线粒体途径诱导细胞凋亡，Bcl-2/Bax的比例决定了细胞的命运。

2青光眼视神经损伤与视网膜神经节细胞凋亡

胚胎期视网膜是由神经外胚叶发育而来，从外向内分为10层。其中神经节细胞层约含120万个节细胞，神经节细胞由较大的胞体及多极突触组成，是视觉器官的三级神经元，轴突进入神经纤维层，由视乳头穿行出眼球，被神经胶质细胞分割成神经纤维束，在巩膜水平通过10层连续片穿过筛板，神经纤维通过筛孔与外侧膝状体核的神经元形成突触联系，将视觉信息传入中枢神经系统。

青光眼的病理改变主要表现为神经节细胞及其轴突的变性、萎缩、丧失[12]。其机制尚不完全明确，国外研究表明，高眼压引起的轴浆运输阻断，可引起阻断处的膜性细胞器，如线粒体、内质网等细胞内容物在筛板处积聚，造成轴突肿胀[13-14]。同时细胞膜通透性增高，使Cl-、Na+、Ca2+、水进入细胞内，水钠潴留，神经元细胞水肿坏死。细胞坏死破裂后，谷氨酸由细胞内进入细胞间隙，同时Mǘller细胞活化，导致肿瘤坏死因子α的释放，引起谷氨酸摄取障碍，使过量的Ca2+进入细胞，引起突触后反应，并通过Ca2+依赖的凋亡信号通路激活钙敏感酶导致神经节细胞凋亡。破裂的神经节细胞释放的谷氨酸可引起正常神经节细胞继发性凋亡[15]。神经节细胞凋亡过程中线粒体是细胞凋亡的主要作用位点，其膜通透性的变化是凋亡早期标志之一。细胞水肿使膜通透性增加，Ca2+内流后线粒体膜电位降低，释放大量促凋亡因子，包括caspase、细胞色素C和凋亡诱导因子凋亡诱导因子等。细胞色素C启动凋亡主要是通过与凋亡蛋白水解酶活化因子1结合，使凋亡蛋白水解酶活化因子1之间相互聚合，聚合物与caspase-9前体形成复合体(即凋亡小体)，进而激活caspase效应蛋白。caspase在正常细胞中以非活性的酶原形式存在，只有在特定条件下caspase才可被特定的蛋白水解，引起凋亡程序的启动。

3Bcl-2/Bax在视网膜神经节细胞凋亡中的作用机制

正常情况下Bcl-2和Bax两种蛋白的表达量相对稳定，以维持细胞稳态，而当眼压增高，神经节细胞内Bax蛋白在细胞内超表达，Bax/Bax同源二聚体的数量明显增多；Bc1-2高表达时，则Bax/Bax二聚体解离，生成更为稳定的Bcl-2/Bax异源二聚体，对抗其诱导凋亡的作用。Levkovitch-Verbin等[16]在不同的青光眼模型中检测到Bax基因相对上调，Bcl-2蛋白中的Bax-xl显著降低，因此，在高眼压状态下，神经节细胞是否发生凋亡，与Bax/Bcl-2的比例关系密切。

3.1Bcl-2在视网膜神经节细胞凋亡中的作用机制

3.1.1抑制细胞色素C释放高眼压引起的轴浆阻滞使细胞缺血、缺氧并大量自由基释放，刺激细胞色素C从磷脂层释放，细胞色素C必须穿过Bax蛋白孔隙释放到细胞质，刺激形成凋亡小体，激活下游的caspase-9，活化的caspase-9进一步激活caspase-3，引起caspases级联激活反应。Bcl-2可通过与Bax结合，导致Bax构象改变，阻止细胞色素C释放进入细胞质，研究证实，通过钙调磷酸酶磷酸化促凋亡因子Bad，使其与Bcl-xl结合，降低Bcl-xl活性，可增加细胞色素C的释放，启动细胞凋亡[17-18]。

3.1.2下调细胞内Ca2+水平Huang等[19]和Sappington等[20]证实，眼压升高将激活钙蛋白酶，引起Ca2+水平升高，激活Ca2+依赖的凋亡信号通路，钙调磷酸酶是线粒体依赖性凋亡的关键调节因子之一，眼压升高激活钙调磷酸酶，引起下游caspase-9的激活，导致神经节细胞的凋亡。实验发现[18]，通过加入钙调磷酸酶抑制剂可以明显抑制caspase-9的激活，从而降低神经节细胞的凋亡。Bcl-2的特殊拓扑结构可控制离子通道开放，降低细胞质内Ca2+水平，同时Bcl-2高表达可使钙调磷酸酶的活性降低，抑制Ca2+依赖的细胞凋亡。

3.1.3抑制星形胶质细胞活化青光眼模型中发现大量活化的星形胶质细胞，它可通过产生一氧化氮合酶2合成一氧化氮，刺激细胞释放促炎性因子(如肿瘤坏死因子α)，激活caspase蛋白，启动凋亡程序[21]。Almeida等[22]认为，Bcl-2可抑制miR-181的表达，从而抑制星形胶质细胞的活化，并促进神经节细胞轴突再生，Bcl-2对星形胶质细胞的抑制作用也在多个实验中被发现。

3.2Bax在神经节细胞凋亡过程中作用

3.2.1维持电压依赖性阴离子通道开放Bax可与电压依赖性阴离子通道作用诱导细胞色素C释放[23]。研究表明[24]，Bcl-2家族抗凋亡蛋白的BH4结构域对电压依赖性阴离子通道的开放有抑制作用，而Bax和Bak的作用类似激活剂使电压依赖性阴离子通道维持在一个开放的状态，Bax可与电压依赖性阴离子通道二聚体绑定而加大它的孔径利于细胞色素C通过，激活caspase启动凋亡机制，同时Bax可引起线粒体外膜的完整性丢失，细胞器裂变溶解。

3.2.2促进视神经轴突损伤高眼压模型中发现，神经节细胞内Ca2+水平增高[19]、活性氧类增多，通过氧化应激激活BH3-only蛋白，活化的BH3-only蛋白激活Bax，Bak引起凋亡[25]。Zalewska等[26]研究闭角型青光眼的视神经轴突发现，凋亡Bak和Bax蛋白表达明显高于抗凋亡Bcl-2和Bcl-xL蛋白，证明Bax在青光眼轴突损伤中发挥了积极作用。

3.3.3对抗Bcl-2抗凋亡蛋白位于神经节细胞线粒体的促凋亡蛋白Bax，暴露出BH3螺旋，与Bcl-2蛋白中BH1和BH2两个同源结构域形成的疏水凹槽结合，通过静电和疏水作用形成异源二聚体，二聚体的形成阻止了Bcl-2的生物活性[27]。同时，过多的Bax蛋白形成Bax/Bax同源二聚体，细胞对死亡信号的反应性增强，启动凋亡[28]。

4小结

青光眼致盲率极高，其高眼压引起的内环境改变，最终均可能通过Bcl-2家族途径引导细胞凋亡。目前对青光眼视神经保护的研究，主要是通过阻止神经节细胞的凋亡，达到延缓视神经损坏的目的。通过研究视网膜神经节细胞的凋亡途径，了解Bcl-2家族在凋亡过程中的作用机制及信号通路，可有选择性地改变Bcl-2家族的表达，阻断线粒体凋亡途径，阻止青光眼神经节细胞凋亡。这将给无数青光眼患者带来福音。

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Research Progress of Bcl-2,Bax in Glaucoma Retinal Ganion Cell ApoptosisWANGXue-wei，LIYan.(DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliateHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650031,China)

Abstract:Glaucoma is one of the three major blinding eye diseases to human,and apoptosis of retinal ganglion cells is known to play a key role in the process of optic nerve damage.However,the pathway of ganglion cell apoptosis and signaling avenue is not entirely clear.Bcl-2 family is one of the regulatory factors for apoptosis of retinal ganion cell involved in the process.The proportion of Bcl-2/Bax determines whether ganglion cells are dying.Here elaborates the mechanism of action and research progress of Bcl-2 family in glaucoma retinal ganion cell apoptosis.

Key words:Glaucoma; Bcl-2/Bax; Ganglion cells; Cell apoptosis

收稿日期：2014-12-22修回日期:2015-04-28编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.22.017

中图分类号：R775.2

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)22-4077-03