正交试验优选过塘蛇的水提工艺

2015-12-08陈建惠卢汝梅农梅冬

中成药 2015年12期

关键词：中医药大学药材次数

李兵，陈建惠，卢汝梅，农梅冬，钟江

（1.广西中医药大学，广西南宁530200；2.广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530012）

正交试验优选过塘蛇的水提工艺

李兵1，陈建惠1，卢汝梅1，农梅冬1，钟江2*

（1.广西中医药大学，广西南宁530200；2.广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530012）

目的优化过塘蛇的水提工艺。方法正交试验法考察液料比、提取时间、提取次数对过塘蛇干膏率及没食子酸含有量的影响。结果优选出的最佳提取工艺为液料比16∶1，提取时间60 min，提取3次。结论该工艺稳定可行，有效成分提取率较高，适合大规模生产需求，可为过塘蛇制剂生产提供参考。

过塘蛇；水提取；干膏率；没食子酸；正交试验

过塘蛇是柳叶菜科水龙属植物水龙Jussiaea repens L.的全草［1］，在广西中医药大学第一附属医院被广泛用于治疗各种疱疹，具有较好的疗效，而没食子酸是过塘蛇中的主要活性成分之一，具有抗肿瘤［2-3］、抗炎［4］、心血管保护［5-6］等作用，在药材或制剂中常用HPLC法加以测定，作为质量控制指标性成分［7-8］。目前，过塘蛇在民间主要以汤剂入药，现代研究报道较少，其物质基础研究尚属空白，在一定程度上制约了该植物的现代化开发利用，因此本实验对过塘蛇提取工艺进行研究，为制备颗粒剂提供参考。查阅文献发现，以水为提取溶剂，经提取、浓缩、干燥、制粒而成的浓缩颗粒，具有体积小、药性强、药效高、起效快、容易储存、方便服用和携带等优点［9］。研究表明［10-12］，目前主要采用正交试验法优化中药提取工艺，故本实验为找到适合大规模生产的过塘蛇颗粒制备工艺，提高其稳定性，保证疗效，以干膏收率和没食子酸含有量为指标，采用正交试验法考察过塘蛇的提取工艺，为其工业化生产提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器岛津LC-20A HPLC色谱仪，包括5C18-PAQ Cosmosil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm）（岛津国际贸易上海有限公司）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯公司）；Millipore Simplicity-185超纯水器（美国密理博公司）；SK2200LHC超声仪（53 KHz，上海科导超声仪有限公司）。

1.2 试药没食子酸（中国食品药品检定研究院，批号110831-201204）。过塘蛇购自玉林药材市场，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为柳叶菜科水龙属植物水龙Jussiaea repens L.的全草。

2 方法与结果

前期本课题组已对过塘蛇含有量测定方法进行了考察［13］，而本实验采用正交试验法进一步优选其水提工艺。

2.1 样品溶液的制备将过塘蛇药材粉碎，过二号筛，精密称取适量，将不同方法提取的过塘蛇提取液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 干膏率的测定精密吸取各提取液20 mL，置于已恒定质量的蒸发皿中，按《中国药典》2010年版一部附录IXG干燥失重法测定，计算干膏率。

2.3 单因素试验

2.3.1 提取时间的考察精密称取过塘蛇药材（过二号

筛）10 g，25倍量水回流提取，提取时间分别为20、40、60、80、100 min，测定没食子酸含有量［13］，再按 “2.2”项下方法测定干膏率，结果见图1、图2。由图可知，当提取时间为60 min时，没食子酸含有量及干膏率趋于平衡，综合考虑，选择40～80 min。

图1 提取时间对没食子酸含有量的影响

图2 提取时间对干膏率的影响

2.3.2 加水量的考察精密称取过塘蛇药材（过二号筛）10 g，分别加8、12、16、20、24倍量水，回流提取60 min，测定干膏率和没食子酸含有量，结果见图3、图4。由图可知，当液料比为12∶1时，干膏收率已趋于缓和，并且没食子酸含有量随溶剂量的增加变化不大。综合考虑，选择12～16倍量水。

图3 加水量对没食子酸含有量的影响

图4 加水量对干膏率的影响

2.3.3 提取次数的考察精密称取过塘蛇药材（过二号筛）10 g，加16倍量水，提取60 min，回流提取5次，测定干膏率和没食子酸含有量，结果见图5、图6。由图可知，提取3次后，没食子酸含有量几乎可以忽略不计，干膏率也下降到5.23%。综合考虑，选择提取1～3次。

图5 提取次数对没食子酸含有量的影响

图6 提取次数对干膏率的影响

2.4 过塘蛇水提工艺的优选

2.4.1 因素水平安排在单因素试验结果的基础上，考察提取时间（A）、加水量（B）、提取次数（C）这3个因素对没食子酸含有量及浸膏得率的影响，按L9（34）正交表设计试验，见表1。

表1 正交试验设计因素水平表

2.4.2 正交结果每个试验条件平行3份，按 “2.2”项下方法测定过塘蛇的浸膏得率，再测定提取液中没食子酸的含有量［13］，结果见表2～4。由表2可知，影响干膏率和没食子酸含有量的因素均依次为C＞A＞B，即提取次数＞提取时间＞加水量。由表3可知，C因素对没食子酸含有量有显著性差异。综合没食子酸含有量、干膏得率、实际生产和节约能源方面考虑，同时考虑到溶剂为水，价格低廉，为保证提取更完全，因此工艺条件选择为A2B2C3，即提取时间60 min，加水量16倍，提取次数3次。

2.4.3 验证实验取过塘蛇药材3份，根据筛选得到的提取工艺进行验证，结果见表5。由表可知，没食子酸的含有量和干膏率均高于正交试验结果，说明该工艺可行。因此，最终优化的水提工艺为A2B2C3。

3 讨论

本课题组前期已对过塘蛇的化学成分和抗菌活性进行了研究［14］，结果发现没食子酸是过塘蛇的主要活性成分。本实验采用单因素结合正交试验法，以过塘蛇的干膏率及没食子酸含有量为评价指标，特征性强，较单一指标更科学合理，而且优化所得的条件稳定可靠，可为进一步开发过塘蛇提供理论依据。

中药提取主要是采用适当溶剂和方法将其中有效成分或部位尽可能提取出来，并把不需要的成分尽量不提或少提取出来的过程，合理的提取工艺应最大程度提取有效成

分。在预实验中，通过比较不同提取溶剂（甲醇、乙醇、水）、提取方法（回流提取、超声波提取、浸渍法），最终确定以水为提取溶剂进行回流提取，此时没食子酸含有量较高。

表2 正交试验结果（n=3）

表3 没食子酸含有量方差分析

表4 干膏率方差分析

表5 验证实验结果

由方差表可知，提取次数对没食子酸含有量有统计学意义（P＜0.05），而对干膏率无显著性差异。但由直观表可知，提取次数也是影响干膏率的主要因素，而加水量和煎煮时间对干膏率及没食子酸含有量无统计学意义（P＜0.05），故本实验可为进一步寻找适合大规模生产过塘蛇配方颗粒的制备工艺提供参考。同时，在今后的研究中将引入多指标性成分，并对其进行含有量测试，这将能准确客观地反映出颗粒剂提取工艺中有效成分的含有量。

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