周防震， 郑小江， 张晓元

（1.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施445000；2.华南理工大学工业研究总院，广东广州510641）

藤茶活性成分二氢杨梅素对人胚肾细胞和肝细胞增殖的影响

周防震1， 郑小江1， 张晓元2

（1.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施445000；2.华南理工大学工业研究总院，广东广州510641）

目的 探讨藤茶活性成分二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）对人正常细胞增殖的影响。方法 体外培养人胚肾细胞（HEK-293）和肝细胞（L-02），MTT法观察DMY对其细胞增殖的影响。结果 DMY对HEK-293和L-02细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为475.3μg/mL和324.8μg/mL，而阳性对照药物顺铂的IC50分别为7.4μg/mL和7.7μg/mL。结论 藤茶活性成分二氢杨梅素对人正常细胞HEK-293和人L-02细胞具有相对低毒性。

藤茶；二氢杨梅素；细胞增殖；人胚肾细胞；人肝细胞

二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY），大量存在于葡萄科蛇葡萄属植物藤茶（Ampelopsis grossedentata）幼嫩茎叶中。报道表明二氢杨梅素具有抗氧化、抗炎、抗突变、止咳、化痰和抗菌等多种生理活性［1］。近年来二氢杨梅素的抗肿瘤作用日益受到重视，资料显示二氢杨梅素对人鼻咽癌HK-1细胞［2］、白血病HL-60、K562细胞［3］、肺腺癌AGZY-83-a细胞［4］和人乳腺癌MDA-MB-231细胞［5-6］具有较强的增殖抑制作用，然而有关二氢杨梅素对人正常细胞影响方面的研究尚未见报道。本实验以人胚肾细胞 （HEK-293）和人肝细胞 （L-02）为研究对象，研究藤茶活性成分二氢杨梅素对其体外增殖的影响，以期为二氢杨梅素的开发和应用开拓新的视野。

1 材料与方法

1.1 材料 二氢杨梅素由华南理工大学工业技术研究总院张晓元教授从藤茶茎叶中提取 （纯度为98%，HPLC法测定）；细胞培养基 （DMEM）、胎牛血清 （FBS）为美国Gibco公司产品；细胞培养板购自美国Corning公司；胰蛋白酶和青霉素-链霉素双抗溶液购自上海碧云天生物技术有限公司；注射用顺铂（Cisplatin）购自齐鲁制药有限公司；噻唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。HEK-293由湖南中医药大学高强博士提供；L-02细胞由暨南大学临床医学院段华英硕士提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和处理 以每孔4×103的细胞密度将指数增殖期细胞HEK-293和L-02分别接种于96孔板内，培养液为含10%FBS的DMEM，每孔180μL，培养12 h后，每孔加入20μL含不同二氢杨梅素浓度的DMEM完全培养液，二氢杨梅素终质量浓度为20、40、80、160和 320 μg/mL每个浓度设6个复孔。另设空白对照组和阳性药物顺铂组。细胞置37℃二氧化碳培养箱内培养48 h，待用。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 取出“1.2.1”项中培养48 h的细胞培养板，每孔加入5 mg/mLMTT 20μL，继续培养4 h后弃去上清，每孔加入DMSO 200μL，置振荡仪上充分混匀，采用酶标仪，以570 nm为测试波长，630 nm为参考波长，测量各孔吸光度，计算细胞生长抑制率。抑制率为：（对照组A值-实验组A值）/对照组A值×100%。

1.2.3 数据分析 半数抑制浓度IC50（50%Inhibitory Concentration）根据IC50计算软件计算；试验所得数据均用平均数±标准差 （）表示，统计学处理应用SPSS 13.0统计软件包中的One-way ANOVA（单因素方差分析）进行统计分析，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 二氢杨梅素和顺铂对HEK-293细胞增殖的影响 作用48 h，100～180μg/mL的二氢杨梅素对HEK-293增殖具有显著的抑制作用；低于60μg/mL的二氢杨梅素对人HEK-293增殖的影响，与对照组相比不具统计学意义 （图1）；而5～40μg/mL顺铂对HEK-293均有显著的抑制作用（图2）。

2.2 二氢杨梅素和顺铂对L-02细胞增殖的影响 作用48 h，40～160μg/mL二氢杨梅素对L-02细胞增殖具有显著的抑制作用；低于40μg/mL的二氢杨梅素对L-02细胞增殖的影响，与对照组相比不具统计学意义 （图3）；而0.625～20μg/mL顺铂对L-02细胞均有显著的抑制作用（图4）。

2.3 二氢杨梅素和顺铂对HEK-293和L-02细胞的IC50二氢杨梅素对HEK-293和L-02细胞的IC50分别为475.3和324.8μg/mL；而顺铂对HEK-293和L-02细胞的IC50分别为7.4和7.7μg/mL（表1）。

图1 二氢杨梅素对HEK-293增殖的影响

图2 顺铂对HEK-293增殖的影响

图3 二氢杨梅素对L-02细胞增殖的影响

图4 顺铂对L-02细胞增殖的影响

3 讨论

肝和肾是人体重要的器官，对维持正常生理平衡具有十分重要的作用。许多化疗药物缺乏对正常细胞和肿瘤细胞的选择性，不仅可能破坏免疫系统，导致机体对肿瘤的自我保护屏障丧失，而且能损害人体肝、肾等重要器官，进而影响其功能，对人体毒副作用大，严重地影响了药物的临床效果［7］。

表1 二氢杨梅素和顺铂对HEK-293和L-02细胞的IC50

前期研究发现，顺铂对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的IC50为2.53μg/mL（数据待发表），本试验中化疗药物顺铂对人胚肾细胞HEK-293和人肝细胞L-02的IC50分别为7.4μg/mL和7.7μg/mL，表明化疗药物顺铂细胞选择性较差，具有明显的肝、肾毒性，这与文献报道一致［8-9］。苏东林等［10］利用大鼠从活体水平证明了二氢杨梅素的低毒性，Wistar大鼠口服灌胃的最大耐受量为5.0 g/kg，同时还发现二氢杨梅素能有效预防和治疗酒精性肝损伤。张友胜等［11］利用小鼠从活体水平证明了二氢杨梅素的低毒性，小鼠灌胃最大耐受量5.0 g/kg，腹腔注射半数致死量为（1.41±0.13）g/kg。本研究离体条件下藤茶活性成分二氢杨梅素对人正常肾细胞和肝细胞增殖的影响，结果显示二氢杨梅素对HEK-293和L-02细胞的IC50分别为475.3 μg/mL和324.8μg/mL，表明离体条件下二氢杨梅素对人正常细胞HEK-293和人L-02细胞具有相对低毒性。以前的研究［5］发现二氢杨梅素对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的IC50为73.6μg/m L，远远小于二氢杨梅素对人胚肾细胞HEK-293和人肝细胞L-02的IC50，表明二氢杨梅素不仅具有低毒性，其抗肿瘤作用还具有明显的细胞选择性。

藤茶是一种古老的药食两用植物，长期作为类茶植物和中草药在民间广泛使用，其干燥茎叶中二氢杨梅素的含量可达30%以上［12］。近年来，藤茶已逐渐被人们所接受并成为受人们青睐的保健品。本研究从离体条件证明了二氢杨梅素对人正常肝、肾细胞的低毒性，丰富了藤茶安全性的新认识，有助于进一步增强市场和消费者对藤茶的信心，进而加快藤茶的开发和利用步伐。

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细胞MDA-MB-231的体外抗增殖作用［J］.肿瘤防治研究，2012，39（1）：95-97.

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R285.5

B

1001-1528（2015）12-2756-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.040

2014-08-23

湖北民族学院博士启动基金项目 （MY2012B010）

周防震 （1976—），男，博士，副教授，主要研究方向为酶工程与生物制药，Tel：（0718）8438261，E-mail：tentzf.student @sina.com