布图雅， 肖 瑞， 乌日罕， 娜日格乐

（1.内蒙古医科大学蒙医药学院，内蒙古呼和浩特010070；2.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古呼和浩特010070；3.锡盟蒙医医院，内蒙古 锡林浩特026000；4.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特010050）

蒙医尼如哈优化剂对结肠炎相关性结肠癌模型小鼠血清及结肠组织中气体信号分子体系的影响

布图雅1， 肖 瑞2， 乌日罕3， 娜日格乐4

（1.内蒙古医科大学蒙医药学院，内蒙古呼和浩特010070；2.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古呼和浩特010070；3.锡盟蒙医医院，内蒙古 锡林浩特026000；4.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特010050）

目的 通过观察蒙医尼如哈优化剂对氧化偶氮甲烷 （AOM）/葡聚糖硫酸钠 （DSS）诱导的CAC小鼠NO、一氧化氮合酶 （iNOS）、CO、血红素氧合酶 （HO-1）、硫化氢 （H2S）及胱硫醚-γ-裂解酶 （CSE）体系的影响，探讨蒙医尼如哈优化剂对CAC的干预及其部分作用机制。方法 将56只Balb/c雄性小鼠随机分为空白组、模型组、柳氮磺吡啶组、传统组、高剂量组、中剂量组、低剂量组等，采用AOM+DSS法造模，造模完成后各组进行相应处理，检测CAC小鼠血清及结肠组织中NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量。结果 模型组的NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量高于正常组，P＜0.05；高剂量组对NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的下调作用最为明显，P＜0.017。结论 蒙医尼如哈优化剂可降低CAC小鼠血清及结肠组织中NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量，起到保护肠黏膜的作用。

蒙医；尼如哈优化剂；溃疡性结肠炎相关性结肠癌；气体信号分子体系

溃疡性结肠炎相关癌（ulcerative colitis-associated cancer，CAC）是在溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）背景下发生的大肠癌即炎症相关癌［1］，临床资料提示其发病率目前低于结肠癌，发病率为0.6%～17%［2］，临床以腹痛、腹泻、黏液脓便、血便为主要特征。随着炎症的进展，溃疡性结肠炎发生癌变的危险累计率增高，病史为10、20、30年的 UC患者发生癌变的危险性依次为2%、8%、18%［3］，但是，由于UC的发病原因不明，加之目前所应用的美沙拉嗪、5-氨基水杨酸等药物的毒副作用较大，寻求安全有效的治疗药物及方法已成为目前研究热点。

随着内源性气体信号分子相关研究的深入，其生物学效应越来越受到学术界的关注。研究发现，过量产生的NO可诱发 DNA链断裂、基因突变，细胞凋亡、肿瘤的发生［4］，iNOS在此过程中也起主要作用［5］。正常情况下，对胃肠道运动有着调节作用的CO在肠道极少表达，只是在炎症细胞、白介素-1等的诱导下，产生大量的CO。其主要限速酶HO-1具有抗炎症、抗凋亡、抗增生作用，是对肠道的一种保护机制［6］。另有研究表明，高水平的H2S可能通过诱发上皮细胞的功能紊乱而促使UC的发展或肠上皮细胞的恶性转化［7］。可见，上述气体信号分子对结肠的炎症及癌变都有一定影响。

CAC属蒙医大肠 “血痞病”范畴，即宝如热邪易积于大肠，久病借 “赫依”之作用凝结致痞。赫依 （“气”）与血为其主要病因。蒙医认为，赫依是人体赖以进行生命活动的3种能量和基本物质之一。从阴阳角度解释，它有两面性，从五元学说角度看属 “气”。而大肠的生理、病理改变与赫依紧密相关。尽管治疗大肠病变的方药和疗术疗法繁多，但均以调和赫依 （“气”）为要。基于此，我们 提出 “气”与气体信号分子具有相关性乃至对应性的假设，采用具有软化和消除肿瘤功效［8］的尼如哈疗法 （是蒙医的一种传统外治疗法，将蒙药合理配伍成煎剂进行灌肠治疗），观察以镇赫依 （“气”）为主要功效的尼如哈优化剂对CAC的干预并阐明其部分作用机制，以供临床。

通过前期研究我们发现，模型组小鼠结肠肉眼改变以散在、多发性息肉状隆起性病变为主，病理改变以低级别上皮内瘤变和/或高级别上皮内瘤变 （重度不典型增生及原位腺癌）为主；优化剂低、中剂量组肉眼改变均以伴有单发或少数息肉状隆起性病变为主，偶伴溃疡形成，镜下以增生性息肉改变为主，偶见异常隐窝；优化剂高剂量组肉眼改变均以结肠黏膜充血、水肿为主，镜下改变均以黏膜上皮脱落、以腺体增生为主，未见溃疡及明显的异常隐窝、上皮内瘤变。与模型组比较有极显著差异 （P＜

0.01）。下面，我们将着重探讨优化剂对CAC小鼠结肠黏膜保护作用的部分机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雄性Balb/c小鼠56只，平均体质量 （20±2）g。 （北京华阜康生物科技有限公司，许可证号：SCXK［京］2009-0004）。

1.1.2 主要试剂 葡聚糖硫酸钠 （DSS，分子量为50 000）（美国AMERESCO公司，货号0918-10g）；氧化偶氮甲烷（AOM）（美国SIGMA公司，货号A5486-25MG）；石蜡油（美国AMERESCO公司，货号MJ217-100 mL）；NO试剂盒（美国RD公司，货号DZE20293）；CO试剂盒 （南京建成生物工程研究所，货号A101-3）；H2S试剂盒 （美国RD公司，货号DZE20054）；iNOS试剂盒（美国RD公司，货号DZE20450）；HO-1试剂盒 （美国 RD公司，货号DZE20472）；CSE试剂盒 （美国 RD公司，货号DZE20052）。

1.1.3 主要仪器 电热恒温培养箱 （DH4000A，天津泰斯特）；高速冷冻离心机 （HC-3018R，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；全自动多功能酶标仪（MULTISKAN MK3，Thermo，USA）；MINI shaker（MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER）；紫外分光光度计（UV-2000，上海尤尼柯公司）。

1.1.4 实验药物及制备 尼如哈传统剂，处方由诃子、茜草、枇杷叶、藜芦、秦艽花、大黄组成，载于 《甘露四部》，购自内蒙古医科大学附属中蒙医院。制备法：称重，粉碎，梯度 （100～250目孔）过筛成粉末状，蒸馏水煮沸后静置，取上清液备用。

尼如哈优化剂：诃子、石榴、荜茇等组成的15味方药。购自内蒙古医科大学附属中蒙医院。制备法同传统剂。

柳氮磺吡啶肠溶片 （国药准字 H31020840，批号22120608，上海福达制药有限公司），蒸馏水稀释应用。

1.2 模型建立和分组 将所有Balb/c小鼠在昼夜循环（12 h∶12 h），恒湿 （50±10）%，恒温 （22±2）℃条件下适养1周。按体质量随机分为空白组、模型组、柳氮磺吡啶组、传统组、高剂量组、中剂量组、低剂量组等；各组8只。除空白组 （腹腔注射等量的生理盐水）外，将质量浓度为1 g/L溶于生理盐水中的AOM以10 mg/kg腹腔注射一次，连续饮用一周3%DSS（分子量50 000）溶液，继之连续喂养2周普通饮用水 （上述过程为一个循环），共重复三个循环［9］。

1.3 实验方法 实验第10周开始，将空白组与模型组给予等量的生理盐水灌肠；柳氮磺吡啶组以3%柳氮磺吡啶灌肠；传统尼如哈，450 mg/mL质量浓度给予传统组灌肠；尼如哈优化剂分别以450、225、112.5 mg/mL给高剂量组、中剂量组、低剂量组灌肠。经肛门插入，距肛门3 cm处注入药物，为了使药物充分流在结肠内将小鼠倒立3 min。每日灌肠一次，量为0.2 mL/20 g，疗程为11周。

直至疗程结束后，将小鼠禁食12 h，不禁水。进行摘眼球采血（3 500 r/min、4℃离心20 m in后取血清，储存于-20℃），处死后取整段结肠，沿肠系膜剖开，用生理盐水洗净，滤纸吸干后，-80℃液氮中保存。

1.4 检测指标

1.4.1 血清检测 CO的量测定：采用比色法。NO及H2S的量测定：采用酶联免疫法。

1.4.2 组织检测 从液氮中取出结肠组织，按照10%（10 mg组织加入100μL生理盐水）匀浆，以3 500 r/min、4℃离心取上清，采用酶联免疫法检测iNOS、HO-1、CSE等的量。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件使用秩和检验处理数据。数据均用表示。检验水准α=0.05，P＜0.05差异有统计学意义。

表1 各组小鼠血清NO、CO、H2S含有量的比较（）

表1 各组小鼠血清NO、CO、H2S含有量的比较（）

注：与空白组比较，★P＜0.05；各治疗组与模型组比较，☆P＜0.05；各剂量优化剂之间比较，▲P＜0.05；传统组与优化剂组比较，△P＜0.05；柳氮磺吡啶组与优化剂组、传统组比较，●P＜0.05

组别 动物数 NO/（μmol·L-1） CO/（μmol·L-1） H2S/（pg·mL-1）2.03±0.75 0.71±0.25 5.00±0.83模型组 8 10.14±1.70★ 1.34±0.63★ 34.17±6.54★优化剂低剂量组 8 8.42±0.80☆ 1.01±0.50 23.93±6.40☆优化剂中剂量组 8 7.68±0.83☆ 0.77±0.28☆▲△● 17.45±2.95☆优化剂高剂量组 8 6.99±0.34☆▲ 1.36±0.47 10.36±1.29☆▲△尼如哈传统剂组 8 8.14±1.58☆ 1.18±0.41 18.04±7.30☆柳氮磺吡啶组 8 6.08±2.15☆ 0.77±0.44 7.85±4.34空白组8☆●

2 结果

2.1 优化剂对CAC小鼠血清NO、CO、H2S及小鼠结肠组织iNOS、HO-1、CSE的影响 见表1、2。

2.1.1 模型组与空白组相比较，模型组的H2S、CSE、CO、NO、iNOS、HO-1含有量高于空白组（P＜0.05）。说明在CAC病变中H2S、CSE、CO、NO、iNOS、HO-1表达显著增加。

2.1.2 各治疗组与模型组比较，模型组H2S、CSE、NO、 iNOS、HO-1的量高于各治疗组 （P＜0.05），说明各治疗组对H2S、CSE、NO、iNOS、HO-1的量表达均有明显作用。模型组CO的量高于中剂量组 （P＜0.05），说明只有中剂量优化剂组具有下调CO含有量的作用。

2.1.3 不同剂量优化剂组间多重比较，中剂量组对CO的作用最为显著 （P＜0.05），说明高剂量作用显著；高剂量组对 H2S、CSE、NO、iNOS、HO-1的影响最为显著（P＜0.05）。

表2 各组小鼠肠组织iNOS、HO-1、CSE含有量的比较

2.1.4 优化剂与传统组比较，中剂量组对CO调控的作用优于传统组 （P＜0.05）；高剂量组对HO-1的调控作用优于传统组 （P＜0.05）；高剂量组对H2S的调控作用优于传统组 （P＜0.05），说明优化剂作用优于传统剂。

2.1.5 各组与柳氮磺吡啶组相比，高剂量组对HO-1的作用高于柳氮磺吡啶组 （P＜0.05）；中剂量组对CO的作用高于柳氮磺吡啶组 （P＜0.05），说明优化剂较柳氮磺吡啶作用显著。

3 讨论

20世纪80年代中期，被发现的内源性气体分子NO代表一种新型的非受体依赖性信号传导机制，开创了新的研究领域 “气体信号分子”，继NO之后，CO和H2S也被发现［10］。它们具有分子量小、持续产生、弥散迅速及作用广泛等特点，并能自由通过各种生物膜，相互作用，发挥生物学效应［11］，在许多的研究中已被证实和炎性反应有着密切的关系，并且通过干预和调节NO、CO、H2S在炎症反应中的表达，可以明显减轻炎症反应损伤［12］。研究表明慢性炎症常继发肿瘤，而肿瘤组织活检样本中也尚存炎症细胞，证实炎症反应参与肿瘤形成［13］。所以通过减轻炎症反应可干预其癌变进展。

我们通过本实验发现，CAC小鼠NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量显著升高，符合上述指标在CAC病变中的量变化规律。而优化剂高剂量组对NO、iNOS、HO-1、H2S及CSE下调作用显著，中剂量组对CO具有下调作用。说明优化剂可有效抑制CAC小鼠血清及结肠组织中的气体信号分子的产生。降低NO的量，可降低肿瘤的发生风险，抑制iNOS的过分表达，可消除其在NO介导的促瘤作用。调控CO及HO-1，可发挥其抗炎、抗凋亡、抗增生作用，保护肠道。而降低H2S含有量，可干预溃疡性结肠炎的发展或肠上皮细胞的恶性转化。可以说，尼如哈优化剂是通过下调CAC小鼠NO、iNOS、CO、HO-1、H2S及CSE的量，进而起到了保护结肠黏膜，干预CAC病变发展的作用。

该实验是通过实验方法验证蒙医药对CAC防治作用的初次尝试，也是蒙医理论之 “气”与气体信号分子相关性的粗浅探讨，但还需更多、更深入系统的临床及实验研究的验证。笔者认为，在阐明 “气”与气体信号分子内在联系的基础上，立足于蒙医基础理论，应用毒副作用相对较小的天然蒙药，在防治CAC临床中起到辅助作用，提高患者生活质量，具有实际意义。

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R285.5

B

1001-1528（2015）12-2746-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.037

2014-07-14

内蒙古自治区科技计划项目 （kjt11sf07）

布图雅 （1973-），女 （蒙古族），博士，教授，硕士生导师，从事蒙医肠疗治疗溃疡性结肠炎、结肠炎相关性结肠癌的临床与实验研究。Tel：13354711577，E-mail：butuyatl@126.com