赵培敬， 张桂平

（南阳市食品药品检验所，河南南阳473061）

HPLC法同时测定活血通脉片中4种成分

赵培敬， 张桂平

（南阳市食品药品检验所，河南南阳473061）

目的 建立同时测定活血通脉片 （鸡血藤、丹参、赤芍、红花等）中4种活性成分丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A及橙皮苷的HPLC法。方法 活血通脉片70%甲醇提取液的分析采用Welchrom C18色谱柱；乙腈-0.1%磷酸为流动相，梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min；检测波长为230 nm。结果 丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A、橙皮苷的线性范围分别为23.91～143.46μg/mL（r=0.999 8）、5.62～33.75μg/mL（r=0.999 4）、2.61～15.66μg/mL（r=0.999 1）、19.10～114.60μg/mL（r=0.999 7），平均回收率分别为98.5%、98.8%、97.9%、99.2%，RSD分别为1.2%、1.4%、1.0%、0.92%。结论 本法对方中4味主药的特征性成分同时进行测定，简便实用，灵敏准确，重复性好。

活血通脉片；丹酚酸B；芍药苷；羟基红花黄色素A；橙皮苷；HPLC

活血通脉片为 《中国药典》收载品种［1］，由鸡血藤、丹参、赤芍、红花、降香、陈皮、川芎、郁金、麦冬等药味制成，具有行气活血，通脉止痛的功效，临床用于冠心病、心绞痛、气滞血瘀证的治疗。原标准中仅控制了丹酚酸B的含有量，而关于方中其他成分定量测定的研究也有报道［2-4］，但多以单味药的单一成分作为质控目标。本实验参考相关文献［5-7］，对样品处理方法和色谱分离系统进行优化，对方中4味主药丹参、赤芍、红花、陈皮的特征性成分同时进行测定，可在简化检测步骤、节约检测资源的情况下，更好地把关该药品的质量。结果表明，该法简便实用、重复性好，专属性强，可用于该药品质量的有效控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，配四元梯度泵、G1314F型可变波长紫外检测器；Sartorious BP-211D电子天平；KQ-300DE型数控超声波仪。

1.2 试药 实验中所用对照品皆购自中国食品药品检定研究院，分别为丹酚酸B（111562-201110，纯度 98.0%）、芍药苷 （110736-201035，纯度96.5%）、羟基红花黄色素 A（批号 111637-200905，纯 度 91.8%）、 橙 皮 苷 （110721-200512）。

1.3 试剂与样品 乙腈为色谱纯（Welch Materials Inc.）；其它试剂均为分析纯；水为超纯水。活血通脉片样品皆由市场购得。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、橙皮苷对照品适量，加70%甲醇制成每1 mL含丹酚酸B 0.478 2 mg、橙皮苷0.382 0 mg、芍药苷0.112 5 mg、羟基红花黄色素A 0.052 2 mg的混合对照品溶液，作为对照品贮备液。精密吸取2 mL，置10 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品10片，除去包衣，研细，精密称取0.4 g，置20 mL量瓶中，加70%甲醇适量，密塞，超声提取30 min，放冷，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 按处方制法，制备分别不含丹参、赤芍、红花、陈皮的阴性对照样品，按 “2.1.2”项下方法分别制成缺丹参、缺赤芍、缺红花、缺陈皮的阴性对照溶液。

2.2 色谱条件 Welchrom C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸（B）系统，梯度洗脱 （0～12 min，12%A；12～20 min，12%→34%A；20～30 min，34%A；30～35 min，34%→12%A）；检测波长230 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温35℃；进样量10μL。按羟基红花黄色素峰计算，理论塔板数应不低于3 000。

2.3 系统适应性试验 吸取 “2.1”项下3种溶液各10μL，按上述色谱条件分别进样。结果在供试品色谱中，出现与丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A、橙皮苷对照品色谱相同、保留时间一致的色谱峰，并且与其它组分能达到良好分离，分离度均符合药典要求，理论塔板数分别为13 981、9 386、7 815、12 255。而在阴性对照色谱中，与各对照品色谱峰相应的位置上无干扰峰，说明供试品溶液中的其它组分对待测成分无影响，见图1。

图1 对照品 （A）、供试品 （B）、缺红花阴性对照 （C）、缺赤芍阴性对照 （D）、缺陈皮阴性对照 （E）、缺丹参阴性对照（F）HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances（A），sample（B），samplew ithout Carthami flos（C），samplew ithout Paeoniae rub rae Radix（D），sam p le w ithou t Citri reticulatae Pericarpium（E）and sam p le w ithout Salviaem iltiorrhizae Radix et Rhizoma（F）

2.4 线性关系的考察 精密吸取 “2.1.1”项下对照品贮备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，在 “2.2”项色谱条件下测定，以测得的4种成分的峰面积为纵坐标，质量浓度 （μg/m L）为横坐标，分别绘制标准曲线。芍药苷回归方程为Y=10.293 9X-0.694 2，r=0.999 4（n=6）；羟基红花黄色素A回归方程为Y=16.091 1X-1.292 3，r=0.999 1（n=6）；丹酚酸B回归方程为Y= 10.396 2 X+0.973 1，r=0.999 8（n=6）；橙皮苷回归方程为Y=10.035 2X-1.074 9，r=0.999 7（n=6）。结果表明，芍药苷、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、橙皮苷分别在5.62～33.75μg/mL、2.61～15.66μg/mL、23.91～143.46μg/mL、19.10～114.60μg/mL的范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 取 “2.1.1”项下的对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，计算得丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A、橙皮苷4种成分的峰面积RSD分别为0.88%、1.1%、1.5%、1.1%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取批号为10140327的样品，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下测定。结果，丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A、橙皮苷的RSD分别为1.3%、0.69%、1.5%、1.2%，说明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取批号为10140327的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h测定4种成分的峰面积。结果，丹酚酸B、芍药苷、羟基红花黄色素A、橙皮苷的RSD分别为0.94%、1.1%、1.6%、1.2%，表明制备的供试品溶液在8 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 精密称取已测得含有量（丹酚酸B 2.381 mg/片，芍药苷0.567 mg/片，羟基红花黄色A 0.262 mg/片，橙皮苷1.855 mg/片，

片质量0.497 6 g）的活血通脉片6份，每份0.2 g，分别精密加入 “2.1.1”项下的对照品贮备液各2.0 mL，按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并进样测定，以外标法计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests

2.9 样品测定 取不同厂家共12批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，平行3份，在“2.2”项色谱条件下测定4种成分的含有量，结果见表2。

表2 12批样品中4种成分的测定结果 （n=3）Tab.2 Results of four constituentsmeasured in twelve batches of samples（n=3）

从所测得的结果可以看到，不同厂家12批样品在丹酚酸B含有量上的差别不大，而其他3种成分的含有量则差异偏大，尤其是羟基红花黄色素A的含有量，差距达4倍多，超出了正常的不同厂家生产、不同产地药材所带来的可能差异。之所以出现这种情况，可归因于现行标准仅规定了丹酚酸B的含有量，而其他3味药因原标准中未涉及成分定量控制，造成个别厂家钻空子、不严格按工艺投料，以致生产的成药中各成分含有量差异较大，质量参差不齐，所以很有必要对其合理定量，从而更好地监管该药品的质量。

3 讨论

关于多成分的同时检测，在已有的研究中很多采用波长转换的方式，取得了良好的效果［8-11］，本实验也采用了此种方法，以各成分的最大吸收波长为各自的检测波长进行测定，效果较好。同时，也尝试了以4种成分中任一成分的最大吸收波长为单一检测波长的测定方法，发现以230 nm作为检测波长时，其它3种成分亦响应信号强、吸收稳定，效果并不比波长转换的差。故考虑到部分品牌或型号的仪器在波长转换时基线不能自动回零，造成基线不稳，亦本着舍繁从简的原则，最终采用了单波长检测的方式。

方中川芎的特征性成分阿魏酸在理论上，可以与文中的4种成分同时检测［12-13］，所以一开始的实验也将其作为待测成分进行了测定，但结果很不理想，因为其含有量太低，与其它几种成分悬殊太大，甚至在几个批次的样品中检测不到，同批样品中的含有量平行性也很差。究其原因，应该是由于川芎在方中所占比例较小，而阿魏酸在川芎中含有量又低，并且性质不稳定［14］。鉴于此，阿魏酸不宜作为本次实验中的目标成分用于质量控制，故最终仅做4种成分的检测。

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Sim ultaneous determ ination of four active constituents in Huoxue Tongm ai Tablets by HPLC

ZHAO Pei-jing， ZHANG Gui-ping

（Nanyang Institute for Food and Drug Control，Nanyang 473O61，China）

AIM To develop an HPLCmethod for the simultaneous determination of the contents of four active constituents（salvianolic acid B，paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and hesperidin）in Huoxue Tongmai Tablets（Jixuezeng Radix et Caulis，Salviaemiltiorrhizae Radix，Paeoniae rubrae Radix，Carthami flos，etc.）.

Huoxue Tongmai Tablets；salvianolic acid B；paeoniflorin；hydroxysafflor yellow A；hesperidin；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2015）12-2651-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.017

2015-03-18

赵培敬（1975—），男，副主任药师，研究方向为中药质量标准与提高。Tel：13938993643，E-mail：peijingzhao@126.com

METHODS The analysis of70%methanolic extractof Huoxue Tongmai Tabletswas conducted on aWelchrom C18column with acetonitrile-0.1%phosphoric acid asmobile phase in a gradient elution mode at a flow rate of 1.0 mL/min and a detection wavelength of230 nm.RESULTS The linear ranges of salvianolic acid B，paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and hesperidin were 23.91-143.46μg/mL（r=0.999 8），5.62-33.75 μg/mL（r=0.999 4），2.61-15.66μg/mL（r=0.999 1）and 19.10～114.60μg/mL（r=0.999 7），respectively.Their average recovery rates were 98.5%，98.8%，97.9%and 99.2%，and RSDs were 1.2%，1.4%，1.0%and 0.92%，respectively.CONCLUSION Being simple，accurate and reproducible，thismethod is well suited to the simultaneous determination of characteristic constituents of four herbs in Huoxue Tongmai Tablets.