王 彬，李晓齐，曹 红，陈福勇，王永强，郑世军

（中国农业大学动物医学院 农业生物技术国家重点实验室，北京 海淀 100193）

禽白血病J亚群病毒GP85蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

王 彬，李晓齐，曹 红，陈福勇，王永强，郑世军

（中国农业大学动物医学院 农业生物技术国家重点实验室，北京 海淀 100193）

为制备能够区分禽白血病A亚群和J亚群病毒的单克隆抗体，将J亚群病毒gp85基因构建到原核表达载体上，并在大肠杆菌BL21中表达携带His标签的禽白血病J亚群GP85融合蛋白，用复性纯化的融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。4次免疫后取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，经过3次亚克隆后获得1株稳定分泌针对GP85蛋白的杂交瘤细胞株，命名为3B6。经间接ELISA测定，小鼠腹水效价为6.4×105，亲和力解离常数（kD）为2.18× 10-9，这株单抗的亚型为IgG1。通过Western Blot和IFA实验证实该株单抗是针对J亚群病毒蛋白GP85的特异性抗体。初步确定此株单克隆抗体的抗原识别区位于GP85蛋白N端的1-50位氨基酸。该株单抗的制备为ALV-J病毒抗原检测以及致病机理的研究奠定了基础。

禽白血病病毒；GP85；单克隆抗体

J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒引起的一类以生长抑制、免疫抑制和骨髓细胞癌变为特征的传染性肿瘤性疾病[1]，主要引起肉鸡的骨髓细胞瘤[2]。J亚群禽白血病自1988年首次发现以来在世界范围内广泛传播[3]。经垂直传播感染的雏鸡容易发生免疫抑制，降低其对其他病原的抵抗力和疫苗的免疫效果，引起更严重的危害[4]。

Pol基因编码病毒的整合酶与反转录酶；env基因编码病毒囊膜蛋白GP85和GP37。GP85为病毒囊膜表面糖蛋白，通过与宿主细胞表面的受体结合引起GP37构象的改变，进而引起病毒与宿主细胞的膜融合[9]。同时gp85基因编码的蛋白是禽白血病

J亚群病毒的特异性抗原蛋白，可以作为检测禽白血病J亚群病毒特异性抗体的诊断抗原[10]。各种亚型禽白血病病毒的gag和pol同源性为96%～97%，而A-E亚群病毒与J亚群病毒在gp85基因上的同源性为40%左右[11]，这为制备可以用于区分临床常见的外源性禽白血病病毒ALV-A和ALV-J提供了可能。本研究成功制备抗J亚群病毒GP85蛋白的单克隆抗体，可以用于鉴别ALV-A和ALV-J病毒，并且为进一步研究ALV的致病机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种、毒株、细胞与实验动物 质粒pGEX-6P-1-gp85、pET-32a-gp85，ALV-J gp85基因，GP85-His，GP85-GST，DH5-α、BL21，DF-1细胞、SP2/0细胞、禽白血病J亚群病毒CAUHM01株和A亚群病毒BJY01株均由本实验室保存；6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂及仪器 限制性内切酶、LA Taq酶和DNA连接酶，购自TaKaRa公司；His单克隆抗体；高纯单克隆抗体、抗GST单克隆标体，购自Abmart公司；山羊抗小鼠IgG二抗，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；兔抗鸡IgG二抗，购自北京博奥森生物技术有限公司；DMEM高糖培养基，购自Gibco公司；标准胎牛血清，购自Hy⁃clone公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT、HT和 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents，均购自Sigma公司；Centrifuge5810R型低温冷冻高速离心机，购自Eppendorf公司；Alpha ImagerTM2200型凝胶成像分析仪，购自美国Alpha公司；KoDak医学X光显影机102型，购自美国KoDak公司；Sunrise 96孔酶标仪，购自TECAN公司；XDS-1B倒置显微镜，购自重庆光学仪器厂。

1.3 抗GP85单克隆抗体的制备 用纯化得到的GP85-His蛋白免疫小鼠[14]。小鼠血清效价大于1∶10 000时，无菌状态下取免疫小鼠的脾脏，分离脾细胞与SP2/0细胞融合，随后进行阳性克隆筛选、亚克隆[15]。

1.4 抗GP85单克隆抗体的鉴定

1.4.1 单克隆抗体亚型鉴定 按照Sigma公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents鉴定试剂盒说明书进行亚型鉴定。

1.4.2 单克隆抗体特异性鉴定 诱导表达ALVGP85、CIAV-VP2、REV-GP90、IBDV-VP4、ARV-V原核蛋白并进行SDS-PAGE电泳，以制备的抗GP85单抗为一抗，进行Western Blot检测。

1.4.3 单克隆抗体亲和力鉴定 参照文献[16]进行亲和力解离常数（kD）的测定。

1.4.4 Western Blot鉴定 将DF-1细胞以5×104个/孔接种于24孔板中，待细胞密度达到30%～40%时，以ALV-J或ALV-A病毒接种细胞，并设置相应的阴性对照。7 d后收取细胞裂解总蛋白，进行Western Blot鉴定。

1.4.5 间接免疫荧光试验（IFA）鉴定 按照1.4.4所述方法进行病毒感染，参照文献[17]进行间接免疫荧光试验。

1.4.6 抗原识别区分析 将gp85基因按180个碱基的间距分别从N端和C端进行截短，构建到pET-28a载体上，进行原核表达。用Western Blot方法鉴定3B6株单抗抗原表位识别区域。

2 结果

2.1 抗GP85单克隆抗体的制备与亚型鉴定 小鼠经3次免疫，用间接ELISA方法测定小鼠血清效价为1∶12 800。加强免疫后，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合，经过3次亚克隆，获得1株能稳定分泌抗GP85早抗的杂交瘤细胞株，命名为3B6。将杂交瘤细胞注射到经产BALB/c母鼠腹腔内制备腹水，间接ELISA测定小鼠腹水效价为6.4×105，用Sigma公司的ELISA亚型鉴定试剂盒检测表明，此株单克隆抗体的亚型为IgG1。

2.2 抗GP85单克隆抗体特异性检测与亲和力鉴定 抗GP85单克隆抗体可以识别ALV-GP85蛋白，不识别CIAV-VP2、REV-GP90、IBDV-VP4、ARV-σB蛋白（图1A），表明获得的单克隆抗体具有良好的特异性。亲和力检测结果表明，此株单抗的亲和力解离常数（kD）为2.12×10-9（图1B），属于高亲和力的单抗。

2.3 抗GP85单克隆抗体识别ALV-JGP85蛋白

用Western Blot方法检测ALV-J感染DF-1细胞（图2A），试验结果表明，该株单抗能特异性识别ALV-J亚群病毒感染细胞产生的GP85蛋白。以间接免疫荧光试验检测，结果同样表明该株单抗能特异性识别ALV-J亚群病毒感染DF-1细胞产生的GP85蛋白，不能识别ALV-A亚群病毒感染DF-1细胞产生的GP85蛋白（图2B）。以上试验结果表明，3B6株单抗能较好的区分ALV-J亚群和A亚群病毒。

图1 抗GP85单克隆抗体特异性和亲和力测定A：单克隆抗体的特异性分析；B：3B6株单抗亲和力测定

图2 单抗3B6株识别ALV-J感染产生的GP85蛋白A：禽白血病J亚群GP85蛋白的Western Blot检测；B：禽白血病J亚群和A亚群病毒GP85蛋白的IFA检测

2.4 单克隆抗体抗原识别区的确定 用抗His标签抗体作为一抗，Western Blot检测表明GP85截短蛋白均可以表达（图3B）。以3B6单克隆抗体为一抗，通过Western Blot分析3B6株抗体识别的抗原表位所在区域为GP85蛋白N端第1-50位氨基酸（图3C、D）。

3 讨论

禽白血病J亚群自从20世纪80年代被发现以来，表现出很强的流行性和致病性。西方国家在禽白血病的净化上取得了很大成功[18]，然而禽白血病在我国却长期存在，目前不仅在肉鸡中存在广泛传播，并且在产蛋鸡群中也出现了流行[19]。禽白血病目前没有有效的疫苗，也无特效的治疗药物，对白血病进行快速检测就显得尤为重要。我国流行的禽白血病主要由A、B亜群和J亚群病毒引起，近几年J亚群禽白血病出现流行趋势增强及危害程度日趋严重的状况[20]。为解决这些问题，我们针对ALVJGP85蛋白制备单克隆抗体，探索建立快速检测禽白血病的方法，并区分A亚群和J亚群禽白血病病毒。

禽白血病的A、B、C、D、E、J6个亚群的gag和pol基因高度保守，同源性在90%[21]以上，而env基因的同源性在40%左右[22]，并且env中的gp85基因编码的蛋白是禽白血病J亚群的特异性抗原蛋白[23]，所以我们研制禽白血病J亚群特异性抗体时选择了GP85蛋白。虽然国内很多实验室都成功研制了抗GP85蛋白的单克隆抗体[24-27]，但gp85基因存在易发生变异的2个高变区和3个可变区，同时GP85蛋白存在多个抗原表位，再者不同抗体的亲和力不同，使用范围和目的也就不同，因此制备针对不同毒株GP85蛋白的单克隆抗体仍具有重要意义。

图3 单抗抗原表位识别区分析A：gp85基因截短模式图（△1-△6）；B：抗His标签单克隆抗体检测GP85截短蛋白的表达；C：抗GP85单克隆抗体检测抗体识别区；D：抗GP85单克隆抗体识别区模式图

我们将克隆的ALV-J gp85基因与NCBI上传的20个ALV-A gp85基因进行序列比对，发现同源性在30%～40%，氨基酸同源性高的区域主要集中在gp85基因的N端和C端。为了保证GP85蛋白的免疫活性，我们在表达GP85蛋白免疫小鼠时并没有将GP85蛋白进行截短表达，而是在表达筛选蛋白GP85-GST时去除了N端50个和C端30个与禽白血病A亚群病毒同源性较高的氨基酸序列，保证除去与禽白血病A亚群GP85蛋白有连续4个氨基酸以上相同的氨基酸序列，这样筛选出的单克隆抗体不会识别与ALV-A GP85相同的抗原表位，进一步保证了研制的单克隆抗体的群特异性。IFA检测结果也表明，该株单抗可以很好的区分ALV-A病毒和ALV-J病毒。本研究并对所制备的抗GP85单克隆抗体的亚型、特异性、亲和力和抗原表位做了详细分析，为ALV致病机理的研究以及快速检测试剂盒的研发奠定了基础

[1]Wang F，Wang X，Chen H，etal.The critical time of avian leuko⁃sis virus subgroup J-mediated immunosuppression during early stage infection in specific pathogen-free chickens[J].J Vet Sci，2011，12（3）：235-241.

[2]Cheng Z，Q Zhang L，Liu SD，et al.Emerging of avian leukosis virus subgroup J in a flock of Chinese local breed[J].Wei Sheng Wu Xue Bao，2005，45（4）：584-587.

[3]Payne L N，Brown S R，Bumstead N，et al.A novel subgroup of exogenous avian leukosis virus in chickens[J].JGen Virol，1991，72（4）：801-807.

[4]高玉龙，秦立廷，王笑梅，等.家禽病毒性免疫抑制病流行特点与防控对策[J].中国家禽，2012，34（15）：5-11.

[5]Mayo M A，van Regenmortel M H.ICTV and the Virology Divi⁃sion News[J].Arch Virol，2000，145（9）：1985-1988.

[6]Swanstrom R，Wills JW.Synthesis，assembly and processing of viral proreins[M].Cold Spring Harbor（NY）：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1997：263-334.

[7]Crittenden L B.Retroviral Elements in the genome of the chick⁃ens：Implications for poultry genetics and breeding[J].Poultry Avi⁃an Biol Rev，1991，3（12）：73-109.

[8]Venugopal K.Avian leukosis virus subgroup J：a rapidly evolving group of oncogenic retroviruses[J].Research in Veterinary Sci⁃ence，1999，67（2）：113-119.

[9]Walther Mothes，Adrienne L.Boerger，Shakti Narayan，et al.Cell [J].2000，103（4）：679-689.

[10]Venugapal K，Howes K，Flannery D M，et al.Isolation of acutely transforming subgroup J avian leukosis viruses that induce eryth⁃roblastosis and myelocytomatosis[J].avian pathology，2000，29（5）：327-332.

[11]张青蝉.A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D].泰安：山东农业大学预防兽医学，2010.

[12]李忠华.传染性腔上囊病病毒VP5蛋白引起宿主细胞凋亡的分子机理研究[D].北京:中国农业大学，2013.

[13]孙贝贝.鸡B15 MDV CTL表位的鉴定与晶体结构解析及其免疫保护效果研究[D].北京：中国农业大学，2013.

[14]丁琳，李海花，郑世军.松鼠葡萄球菌脱皮毒素C单克隆抗体的制备与识别区域分析[C].第四次猪病学术研讨会会议论文集.郑州，2010：728-730.

[15]YokoyamaWM.Current protocols in Immunology[M].JohnWiley& Sonc Inc，1995：2.5.1-2.6.9.

[16]罗正，刘若尘，郑世军.单核增生性李氏杆菌溶血素的原核表达及其单克隆抗体的制备[J].生物工程学报，2009，25（10）：1652-1657.[17]李翔.新城疫病毒M蛋白与宿主蛋白CHMP4互作影响病毒复制机理的研究[D].北京：中国农业大学，2013.

[18]Payne N L，Nair V.The long view：40 years of avian leukosis re⁃search[J].Avian Pathology，2012，41（1）：11-19.

[19]王琦，王永强，康忠惠，等.蛋鸡J亚群禽白血病病毒SD1009分离株的分离鉴定及全基因组序列分析[J].中国预防兽医学报，2011，33（8）：593-597.

[20]秦红丽，朱明艳.禽白血病病毒J亚群在我国的流行现状[J].畜牧兽医科技信息，2009，12：8-9.

[21]赵冬敏.B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性[D].泰安：山东农业大学，2010.

[22]叶建强.J亚群禽白血病病毒Env分子生物学特性研究[D].扬州：扬州大学，2005.

[23]Venugapal K，Howes K，Flannery D M，et al.Isolation of acutely transforming subgroup Javian leukosis viruses that induce eryth⁃roblastosis and myelocytomatosis[J].avian pathology，2000，29（5）：327-332.

[24]莫虹斐，余多，孙淼，等.J亚群禽白血病病毒GP85单抗1E3株抗原识别表位的初步分析[J].中国兽医杂志，2011，47（12）：3-7.

[25]秦爱建，崔治中，LEELUCY，等.抗J亚群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特异性单克隆抗体的研制及其特性[J].畜牧兽医学报，2001，32（06）：556-562.

[26]朱陈娟.检测J亚群禽白血病病毒抗体的间接ELISA方法建立和针对GP85蛋白的单克隆抗体研制[D].扬州：扬州大学，2011.

[27]王峰.J亚群禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒单克隆抗体的研制[D].泰安：山东农业大学，2011.

Development and identification ofmonoclonalantibodies against Avian Leukosis Virus（ALV）subgroup JGP85

WANG Bin，LIXiao-qi，CAOHong，CHEN Fu-yong，WANG Yong-qiang，ZHENG Shi-jun
（State Key Laboratory of Agrobiotechnology，College of VeterinaryMedicine，China AgriculturalUniversity，Beijing 100193，China）

To develop monoclonal antibodies（McAbs）that can distinguish avian leukemia subgroup A virus from subgroup J virus,we cloned gp85 gene into prokaryotic expression vectors pET-32a and pGEX-6P-1.The expression vectors were transformed into E.coli BL21 for expression of GP85.The purified and refolded fusion protein GP85-Hiswas used as an immunogen to vacci⁃nate BALB/cmice.Then，we fused myeloma cells SP2/0 with splenocytes from the immunized BALB/cmice after four times of im⁃munization.A fter three rounds of subcloning,we obtained a hybridoma cell clone that stably secreted McAbs against GP85 and named 3B6.Antibody titers were 6.4×105as examined by indirect ELISA in ascite fluid ofmice inoculated intraperitoneally with monoclonal antibody-producing hybridoma cells.The dissociation constant（kD）of themonoclonal antibody was determined to be 2.18×10-9and the isotypewas IgG1.Specific recognition of GP85 by anti-GP85monoclonal antibodywas validated by Western Blot and indirect Fluorescence Antibody assay.The epitope in GP85 thatwas recognized by 3B6 was located between 1 to 50 aa as dem⁃onstrated by Western Blot.The McAb will be helpful to the examination of ALV-J antigen and to elucidate the pathogenesis of ALV.

ALV；GP85；monoclonalantibody

s：WANG Yong-qiang；ZHENG Shi-jun

S852.65+9.3

A

0529-6005（2015）11-0023-04

2014-08-04

国家自然科学基金（#31272543）；现代农业产业技术体系建设专项资金（#NYCYTX-41）

王彬（1988-），男，博士生，主要从事病原与宿主相互作用机制的研究，E-mail：6942362@163.com

王永强，E-mail：vetwyq@cau.edu.cn；郑世军，E-mail：sjzheng@cau.edu.cn