操 跃1，2，钱其军2（1.福建医科大学第一临床医学院，福建 福州 350108；2.第二军医大学附属东方肝胆外科医院肿瘤生物治疗科、病毒基因治疗实验室，上海 200438）

·生物治疗·

慢性乙型肝炎的抗病毒研究进展

操 跃1，2，钱其军2（1.福建医科大学第一临床医学院，福建 福州 350108；2.第二军医大学附属东方肝胆外科医院肿瘤生物治疗科、病毒基因治疗实验室，上海 200438）

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的全球性传染病，HBV感染是我国肝硬化、原发性肝癌的重要原因。目前，干扰素类与核苷（酸）类似物抗病毒药物已广泛应用于临床，在一定程度上抑制了病毒的复制并控制了疾病的发展，但仍未从根本上清除病毒；各种治疗性疫苗在抗HBV方面也取得了一定疗效，但临床效果不佳。目前不少研究结果表明，生物免疫治疗可以成功清除体内的HBV，从而为乙肝的治疗带来新的希望。

乙型肝炎病毒；核苷酸类似物；干扰素；治疗性疫苗；生物免疫疗法

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的一种全球性公共卫生疾病。全世界有近40亿的HBV携带者，每年大约有75万人因乙肝反复发病导致的并发症，如肝衰竭、肝硬化、肝癌、肝性脑病、上消化道出血等而死亡。我国的乙肝患者约占全球的1／2，并且每年乙型病毒性肝炎的新发感染者达10万人之多。在这些慢性感染者中，90%是在婴幼儿时期被感染且伴随一生，其原因不明。

1 HBV与免疫的关系

HBV是一种部分双链DNA病毒，属于肝脱氧核糖核酸病毒科家族［1］。基于表面抗原的决定因素和8个核苷酸序列基因型（A～H），HBV被分为4种血清型：adr、adw、ayr和ayw。研究表明，不同的血清型可能与疾病的严重程度和治疗疗效有关。HBV的复制周期始于病毒进入肝细胞，由pre-S1绑定区域的病毒颗粒细胞钠牛磺胆酸盐协同转运多肽，将裸露的HBV导入肝细胞内。在此过程中有两个关键步骤：①形成共价闭环DNA（cccDNA），cccDNA与HBV的免疫耐受有关，至今尚无一种药物可以清除与肝细胞核内基因整合的cccDNA，从而导致乙肝的反复发病。②复制通过RNA作为中间体反转录，这是嗜肝DNA病毒独特的复制方式。整个逆转录过程无校正功能，有先天的错误倾向，导致了HBV的多样变异性，如N146S突变可以阻止HBV表面蛋白糖基化［2］，P120S的突变可能与HBV的免疫耐受有关［3］。而核酸的成熟可能最终增强其抗药性，或通过细胞外分泌使HBV颗粒感染其他肝细胞［4］。我们需要通过更深入地了解HBV周期，以研究出抗HBV的新方案。

人体感染HBV也和机体的免疫系统功能不正常有关，CHB患者通常免疫系统功能低下。免疫系统的紊乱及特异性抗乙肝免疫力低下造成肝细胞反复坏死、再生，最终形成肝硬化，进而发生恶变。

1.1 适应性免疫系统功能低下 免疫学因素可能是最主要的因素，包括：①抗原提呈细胞，特别是树突状细胞（DC）数量减少、功能减弱，导致其提呈抗原的能力及刺激免疫反应的强度均低于正常人［5，6］；②调节性T细胞（Treg细胞）是机体最重要的免疫调节细胞，具有抑制免疫反应、炎症、免疫损伤等功能，CHB患者体内Treg细胞明显增多，有利于HBV感染所导致的免疫耐受；③T细胞表面一些共抑制分子表达增加，包括PD-1、CTLA-4以及Tim-3等。HBV特异性T细胞的缺失或克隆麻痹是HBV慢性感染的主要特征之一。干扰介质（Bim）主要通过诱导CD127低表达使抗HBV特异性T细胞凋亡增加，从而发挥作用［7］。CHB患者非特异性CD8（＋）T细胞功能紊乱导致肝损伤，CD8（＋）T细胞产生IL-2的能力和增殖能力显著下降，但同时CD8T细胞产生促炎症因子IFN和TN的功能却未损伤，因而引起非特异性炎症损伤和反复的肝功能损伤，肝细胞坏死、再生［8］。

1.2 天然免疫系统功能紊乱 CHB患者肝内天然免疫细胞自然杀伤细胞（NK）和自然杀伤T细胞（NKT）大量聚集，以抗原非依赖方式识别并消除肝炎病毒感染的肝细胞是造成肝损伤的重要原因。

2 抗病毒药物

CHB患者有15%～40%发展为肝硬化，其中又有2%～5%的患者发展为肝细胞癌（hepatic cell carcinoma，HCC）［9］，因此，对每一名CHB患者都应进行抗病毒治疗。目前国内批准用于抗HBV的药物有：干扰素类与核苷（酸）类似物，包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定［10-12］。

2.1 干扰素 从血清学、生物医学、病毒学多方面增强其抗病毒作用，干扰素高剂量、长期治疗较低剂量、短期治疗，在使乙型肝炎e抗原（HBeAg）水平、HBV-DNA拷贝量下降率、HBeAg血清转换率、丙氨酸转氨酶（ALT）降至正常的概率方面都有显著的统计学差异［13］。干扰素与特异性受体结合，激活多种信号转导通路，诱导产生具有抗HBV的各种酶和蛋白质，抑制HBV的复制［14］。通过上调抗病毒的免疫水平，在相对短的时间内达到e抗原血清转换而停药。但总的受益人群仍只有约30%。同时，部分患者会出现乏力、头痛、体重减轻等不良反应。

2.2 核苷（酸）类似物 它作用于HBV的聚合酶区，在病毒复制过程中，通过取代延长聚合酶链所需而结构相似的核苷，从而抑制病毒复制。在维持机体特异性抗HBV免疫水平的基础上治疗乙型肝炎，由于没有上调机体特异性抗乙肝免疫水平，出现e抗原血清转换并停药的比例较干扰素少。

近年来，为增加抗HBV的疗效并减少其耐药率，联合抗病毒模式被更多地应用于临床，干扰素类与核苷类药物联合应用对HBV-DNA拷贝量的下降率明显高于单用核苷类药物［15］，更多的数据表明：核苷类药物间的联合抗病毒治疗，可以达到降低HBV-DNA拷贝量的目的［16］，因此，需要更多的研究去证明联合抗病毒和单独抗病毒的疗效差异。目前，临床抗HBV药物取得了一定疗效，但各有其缺陷，都需长期服用，部分患者依从性差，终止服药后可能出现CHB急性重型发作，导致肝衰竭死亡的情况。

3 治疗性疫苗

近年来，研究者也在尝试使用主动免疫的方法治疗HBV［17-19］。现已证实CHB患者免疫功能低下，尤其是特异性T淋巴细胞反应无能和低下，使得机体对HBV呈现免疫耐受而不能产生特异性免疫应答，因此无法有效清除HBV［20］。治疗性疫苗正是通过打破HBV患者的免疫耐受，增强其免疫应答，达到清除病毒的目的。

3.1 蛋白疫苗的研究 将HBV重组蛋白制成疫苗，并增强其免疫原性，包括现有的重组乙肝表面抗原（HBsAg）疫苗、HBV核心抗原（HBcAg）与HB-sAg联用疫苗等，目前国外已做Ⅰ期或Ⅱ期临床试验，疗效短且治疗效果与对照组无显著差异［21］。

3.2 DNA疫苗的研究 模拟病毒的自然感染过程，希望通过激活机体对HBV的特异性细胞免疫达到抗HBV的效果。抗原主要在肌细胞表面表达，但因肌细胞表面缺乏共刺激因子B7.1与B7.2，无法刺激足够强的免疫反应，而基因枪的应用可以解决这一问题，但因设备的限制使其无法得到广泛的应用［22］。韩国研究人员将DNA疫苗和拉米夫定联用，患者耐受性好，有50%的患者病毒滴度降低，伴随产生HBV特异性分泌IFN的T细胞，CD4记忆性T细胞在治疗结束40周后仍能被检测到，但该临床试验没有设对照组。常见的毒副作用包括注射部位反应（39%）和转氨酶升高（11%），少数患者有严重的不良反应［23，24］。

3.3 DC疫苗的研究 DC是目前已知的体内功能最强的抗原提呈细胞（APC），与其他APC相比，DC的最大特点是能够活化初始T细胞。CHB患者外周血中DC的增殖数量较正常人明显降低。研究者通过多种方式恢复和增强CHB患者DC的抗原提呈功能，表明该疫苗能够有效打破HBV耐受，刺激有效的特异性免疫应答，达到杀伤HBV的目的，目前仍处于研究阶段。

4 生物免疫治疗

研究表明，可以成功清除HBV的患者体内，通常有足够强的针对核心抗原的特异性细胞毒性T细胞（CTL）免疫应答。CTL清除HBV主要通过2条途径：胞毒途径和非溶胞途径［25］。在特异性CTL清除病毒的过程中，非溶胞途径可能扮演着更为重要的角色［26］，但一般CHB患者体内的免疫反应低下。根据对HBV变异多样性的分析，HBV分为8种（A～H），不同地区感染的HBV病毒有所差异，且不同的基因型病毒对疾病的进展及预后的影响不同。我国HBV主要是B型和C型，B型较C型较少引起肝脏的损伤和疾病的进展［27］。通常我们主要鉴定2种HBV变异体：HBV-SH（SH）和HBVSH-DPS（SH-DPS）。SH和SH-DPS的共表达可以增加HBV的复制，导致核心抗原的融合，用其感染小鼠，发现小鼠可以诱导更强的特异性CTL免疫应答［28］。这就要求明确可诱导特异性CTL反应的免疫靶点。

由于同种异型抗原（MHC）的限制性，不同免疫靶点对CTL的亲和力高低不同，导致抗病毒的免疫反应强弱也不同。现已明确44个与HLA-1型相关、32个与HLA-2型相关的乙肝特异性抗原，大多数HLA-1类抗原可以明确在HLA-A2阳性患者体内有影响HBV急性感染的作用，在表位和基因型之间有重要的变异性。新的抗HBV免疫疗法可能为患者带来希望，但目前仍处于实验阶段。

HBV明确的某一抗原靶点可以刺激特异性CTL反应，对抗HBV而言有重要作用。中国人的HLA-A33阳性率（6%～20.9%）较其他人种高，严重的乙型肝炎患者较康复者高表达HLA-A33基因型，慢性感染HBV的患者HLA-A33基因型表达更多。利用MHC的限制性，从B、C型HBV病毒中提取S、C、X和P蛋白中HLA-A33高亲和力的多肽，我们发现了5个高亲和力的多肽：HBs245～ 253、HBs335～343、HBc119～127、HBc104～112、HBp391～399。研究表明，这5种多肽均可诱导足够强的特异性CTL免疫反应，其中HBp391～399增强诱导CTL反应的能力最强［29］。

同时，通过研究MHC的限制性，我们了解到HBcAg阳性率较HBsAg覆盖的人群范围更广，亲和力更高，刺激CTL反应更强，但需要更多的数据加以证明。HBsAg诱导刺激特异性CTL免疫应答弱，脑苷脂（a-galactosylceramide a-GalCer）是一种特殊的自然杀伤细胞兴奋剂，可以刺激诱导吲哚胺、加双氧酶的产生［30］。脑苷脂可以增强HBsAg诱导刺激特异性CTL免疫应答的强度［31-33］，但吲哚胺、加双氧酶可以抑制特异性CTL免疫应答的强度。我们通过抑制吲哚胺、加双氧酶的活性，可以增强HBsAg和a-GalCer诱导刺激特异性CTL免疫应答的强度。

乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的141～149基因片段与HLA-A2的CTL细胞高亲和力，可以诱导特异性CTL反应，以其作为免疫靶点，可以使HBsAg转阴率达到35.5%，且HBV-DNA拷贝量下降率有统计学差异。HBcAg 18～27被广泛用于作为HBV的免疫靶点诱导特异性CTL反应［34，35］，但其免疫应答大多很弱。Tap相关蛋白（Tapasin）是一个内质网分子伴侣。近年来研究表明，胞浆转导肽（cytoplasm ic transduction peptide，CTP）-HB-cAg 18～27-Tapasin融合蛋白可以进入树突状细胞内［36］，在体外可以增强T细胞应答，并有效地产生特异性CTL。现研究表明，CTP-HBcAg18～27-Tapasin融合蛋白相对于CTP-HBcAg18～27融合蛋白和HBcAg18～27-Tapasin融合蛋白，高表达IFN-γ、IL-2和特异性CTL细胞，并且融合蛋白诱导增强的特异性CTL反应可以降低HBV-DNA和HBsAg的水平及HBsAg和HBcAg在肝组织中的表达。

5 总结

90%的CHB在婴幼儿时期感染，目前没有治愈的方法，临床上用于抗HBV的治疗主要是核苷类似物和干扰素类。但两者各有其缺陷，尚无法满足患者的需求。近年来，研究者从HBV和机体免疫系统的联系方面做了大量研究及临床试验，试图打破感染HBV后机体的免疫耐受，并取得了一定成绩。大量数据表明：特异性CTL免疫反应是消除HBV的关键，相信在不久的将来，细胞免疫治疗CHB定能取得令人满意的疗效。

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Progress in study of antiviral effect of chronic hepatitis B

CAO Yue1，2，QIAN Qijun2（1.FirstClinicalMedical College，Fujian Medical University，Fuzhou 350108，China；2.Laboratory of Gene and Viral Therapy，Departmentof Biotherapy，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital Affiliated to Second M ilitary Medical University，Shanghai200438，China）

Chronic hepatitis B is aworldw ide infectious diseases caused by hepatitis B virus（HBV）.HBV infection is an important reason for liver cirrhosis and liver cancer in our country.Currently，the interferon and nucleoside analogs antiviral drugs（nucleotides）is w idely used in clinical practice.These drugs inhibit the replication of the virus and disease development to a certain extent，but not fundamentally eliminate the virus.Various therapeutic vaccines have also made certain curative effect in anti HBV，but the effect is not perfect clinically.A t present，many research results demonstrate thatbiological immunotherapy can successfully eliminate HBV virus in the body，therefore it has brought a new hope for the treatment of hepatitis B.

hepatitis B virus；nucleoside analogues；interferons；therapeutic vaccines；biological immunotherapy

R512.62

A

1006-0111（2015）06-0561-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.06.022

2015-02-10

2015-07-13［本文编辑］李睿旻

操 跃，硕士研究生.Tel：13122832159；E-mail：290031131＠qq.com

钱其军，主任医师.研究方向：免疫细胞过继治疗及肿瘤的基因、病毒治疗.E-mail：qianqj＠sino-gene.cn