戴 一，宋祖荣，李 静

（安徽新华学院药学院，安徽，合肥 230088）

冬凌草为植物碎米桠（Rabdosia rubescens(Hemls.) Hara）的干燥地上部分，主产于河南、湖北、安徽等多个地区，济源当地民间用其煮茶饮用治疗咽喉肿痛，现市场上冬凌草作为茶销售深受人民欢迎。冬凌草味甘苦，性微寒，具有清热解毒，活血止痛之功效[1]，主要含有冬凌草甲素、冬凌草乙素等对映贝壳杉烷型二萜及黄酮、多糖等成分[2-3]。现代药理表明黄酮成分多具有抗衰老、保护心血管等作用[4]，多糖多具有免疫调节[5]，冬凌草甲素具有抗癌[6-7]、抗炎[8]等多种药理活性。然而冬凌草作为茶研究并不深入，目前尚未见其茶中成分定量研究及泡茶条件的探索。为了揭示冬凌草茶保健作用的物质基础，本实验选择对冬凌草茶中的多糖、总黄酮及冬凌草甲素进行了定量分析，并探讨了冬凌草茶的较佳浸泡温度，为科学开发和合理使用冬凌草茶提供可靠的实验依据。

1 材料

1.1 药物与试剂

冬凌草（购置于亳州药材市场，产地湖北，经安徽新华学院庆兆老师鉴定为冬凌草 Rabdosia rubescens(Hemls.) Hara）。冬凌草甲素（上海融禾医药科技有限公司，批号：140109），芦丁对照品（天津一方科技有限公司），甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

安捷伦 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；梅特勒-托利多AB135-S电子分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司）；FA2004型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司），8510E-DTH超声提取器（美国必能信公司），DZF-6020型真空干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 冬凌草茶的制备

精密称取冬凌草5.00 g，6份，加20倍量水，于圆底烧瓶中分别用100、90、80、70、60、50 ℃浸泡1 h，浸泡结束定容至100 mL，浸提液4000 r/min离心10 min，得冬凌草茶备用；另取冬凌草5.00 g，20倍量水室温超声1 h，同上离心后制备茶液作为对照。

2.2 冬凌草茶中多糖的含量测定

2.2.1 5%苯酚液的制备

称取苯酚100 g，加铝条0.1 g，碳酸氢钠0.2 g，蒸馏，收集182 ℃馏份，称定5 g，置于100 mL棕色溶量瓶中，加少量水溶解后，定容，充分混匀，冷藏，备用。

2.2.2 冬凌草茶多糖供试液的制备

精密量取各冬凌草茶7 mL，加3 mL氯仿-正丁醇(4:1)的Sevag试液，超声15 min，4000 r/min离心l0 min，去除下层氯仿及中层变性蛋白，取上部水层反复操作3次，至无明显中层。收集去蛋白后的上部水层5 mL，加无水乙醇至醇浓度为80%，静置过夜，4000 r/min 离心l0 min，沉淀加水溶解定容于25 mL溶量瓶中，即得冬凌草茶多糖供试液。

2.2.3 葡萄糖对照品溶液的配制及标准曲线的绘制

精密称取葡萄糖对照品 27.5 mg，加水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得浓度为0.275 mg/mL 的对照品溶液。精密吸取葡萄糖对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分别置10 mL干燥容量瓶中，加水至1 mL，另取水1 mL作为空白对照。分别加入5 %苯酚溶液2.0 mL，摇匀，然后缓慢加浓硫酸7.0 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，于490 nm测定吸光度[9]。

2.4.4 冬凌草茶多糖供试液测定

精密吸取1 mL冬凌草茶多糖供试液置10 mL容量瓶，另取水做对照，分别加入 5 %苯酚溶液2.0 mL，摇匀，然后缓慢加浓硫酸7.0 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，在490 nm处，测定吸光度，计算冬凌草茶中多糖浸出率，即每100 g冬凌草在相应条件下浸出的多糖量(g)。

2.3 冬凌草茶中总黄酮的含量测定

2.3.1 芦丁对照品溶液制备与标准曲线的绘制

精密称取干燥至恒重的芦丁对照品10.0 mg 置于25 mL 量瓶中，加入甲醇，超声使完全溶解，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得0.400 mg/mL 的对照品溶液，置冰箱中备用。精密吸取0.4 mg/mL的对照品溶液0、1. 0、2. 0、3.0、4. 0、5. 0、6. 0 mL 分别置于25 mL 的量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1. 0 mL，摇匀，放置6 min；加10% 硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min；加4%氢氧化钠溶液10.0 mL，摇匀，再加蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置10 min，以甲醇溶液为空白对照在500 nm波长处测定吸光度[10]。

2.3.2 冬凌草茶总黄酮测定

精密量取冬凌草茶1 mL，加5% 亚硝酸钠溶液1 mL，使混匀，放置6 min，加10% 硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠试液10 mL，蒸馏水定容至25 mL，摇匀，放置10 min，在500 nm 波长处测定吸收度，计算每100 g冬凌草在相应条件下浸出的总黄酮量(g)。

2.4 冬凌草茶中冬凌草甲素含量测定

2.4.1 色谱条件

Agilent HC-Cl8柱(250 mm×4.6 mm, 5 µm)，检测波长238 nm， 流速1.0 mL/min， 柱温25 ℃，流动相甲醇-水( 49:51)[11]，进样量：20 μL。

2.4.2 对照品溶液制备

精密称取冬凌草甲素5 mg ，置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度备用。

2.4.3 冬凌草茶供试液制备

量取冬凌草茶10 mL，以0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试液。

2.4.4 线性关系考察

精密吸取冬凌草甲素对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL以甲醇定容至10 mL，摇匀，吸取对照品溶液20 µL进样分析，以浓度（C）对峰面积（A）绘制标准曲线。

2.4.5 精密度实验

取同一质量浓度的冬凌草甲素对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积，计算峰面积的RSD。

2.4.6 重复性实验

精密称取冬凌草粉末5.00 g，共6份，按2.4.3节方法制备供试品溶液后按 2.4.1节条件下进行测定，计算冬凌草中冬凌草甲素浸出率的RSD。

2.4.7 稳定性实验

同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8 h后进样分析，计算冬凌草甲素峰面积的RSD。

2.4.8 回收率实验

精密称取 6份已测定冬凌草甲素含量的药材1.00 g，按冬凌草甲素含量的100%比分别加入冬凌草甲素对照品，选取 50 ℃条件下制成冬凌草茶供试液后进行分析，计算冬凌草甲素的平均回收率。

2.4.9 样品含量测定

精密吸取冬凌草茶供试液20 μL，按2.4.1节色谱条件下分析，测定峰面积，计算冬凌草茶中冬凌草甲素浸出率，即每100 g冬凌草在相应条件下浸出的冬凌草甲素的量(g)。

3 结果

3.1 冬凌草茶中多糖、总黄酮定标准曲线

3.1.1 葡萄糖标准曲线

对7个不同浓度的葡萄糖对照品溶液进行苯酚-硫酸显色后，在490 nm测定吸光度，以质量浓度(C)对吸光度值(A) 作回归统计分析。回归方程为：Y = 0.0294X+0.1667（R2= 0.9980），表明葡萄糖在2.75～19.25 μg/mL范围内线性关系良好。标准曲线见图1。

图1 葡萄糖对照品标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

3.1.2 芦丁标准曲线

对5个不同浓度的芦丁对照品溶液采用铝盐法显色后，于500 nm测定吸光度，以质量浓度(C)对吸光度值(A) 作回归统计分析。回归方程为：Y = 13.989X-0.0484（R2= 0.9991），表明芦丁在 0.016～0.096 mg/mL范围内线性关系良好。标准曲线见图2。

图2 芦丁对照品标准曲线Fig.2 Standard curve of rutin

3.2 冬凌草茶中多糖、总黄酮浸出率测定

对由不同温度下冬凌草水浸提液制备的茶进行相应供试液制备后，经显色后测定冬凌草茶中多糖及总黄酮的浸出率，结果见表1。

表1 不同温度下冬凌草茶中多糖、总黄酮的浸出率Table 1 The extracting rate of polysaccharides and total flavonoids in Rabdosia rubescens tea at different temperatures

由表1可见，冬凌草茶中多糖与总黄酮随着浸泡温度的升高均逐渐升高，用100 ℃水浸泡时的多糖及总黄酮浸出率均比 50 ℃时的浸出率要高近 3倍。而超声条件下的多糖和总黄酮浸出率仅相当于50 ℃水的浸泡。

3.3 冬凌草茶中冬凌草甲素浸出率测定

3.3.1 冬凌草甲素标准曲线的绘制

不同浓度的冬凌草甲素对照品溶液20 µL进样分析，对照品色谱图见图3。以浓度(C)对峰面积(A)绘制标准曲线，得冬凌草甲素回归方程分别为A = 27752C-106.64，R2= 0.9995，在0.013～0.065 mg/mL浓度范围呈良好的线性关系。标准曲线见图4。

图3 冬凌草甲素对照品HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of oridonin

图4 冬凌草甲素对照品标准曲线Fig.4 Standard curve of oridonin

3.3.2 精密度实验、重现性、稳定性实验

对同一质量浓度的冬凌草甲素对照品溶液重复进样6次，计算峰面积RSD为0.99 %，精密度良好。对6份冬凌草制备的茶供试液进行测定，结果冬凌草甲素浸出率的RSD 值为1.36 %，表明具有较好重现性。对于0、1、2、4、6、8 h后分析的供试液，冬凌草甲素峰面积的RSD为0.94 %，表明冬凌草茶供试液在8 h 内稳定。结果见表2。

表2 精密度、重现性及稳定性实验Table 2 Precision , repeatability and stability experiments

3.3.3 回收率试验

对6份冬凌草甲素的加样回收实验发现，冬凌草甲素的平均回收率为98.47 %，RSD为1.40 %。结果见表3。

表3 冬凌草甲素回收率实验Table 3 Method recovery of oridonin

3.3.4冬凌草茶中冬凌草甲素浸出率测定

对不同提取温度下制备的冬凌草茶供试液进行色谱分析，供试液色谱图为图 5，图谱显示与冬凌草甲素具有一致的保留时间。

图5 冬凌草茶HPLC色谱图Fig. 5 HPLC chromatograms of Rabdosia rubescens tea

对不同温度浸提所获的冬凌草茶及超声提取所得冬凌草茶进行HPLC分析，结果见表4。可见对照试验超声提取具有较高的冬凌草甲素浸出率，远高于50 ℃温浸的0.0661 %，达到0.0749 %，体现了超声提取的优越性，提取效率高，成分破坏小。而用热提的方式，由数据显示，随着温度的升高，冬凌草甲素的浸出率大致呈略降趋势，可能由于太高的温度导致了冬凌草甲素的破坏。因为冬凌草甲素是抗癌消炎的主要成分，应成为饮茶的主要考虑因素，同时考虑冬凌草茶中的多糖及总黄酮，温度太低时这两类成分浸出很低，而在70 ～80 ℃时冬凌草茶的多糖及总黄酮浸出率亦较高，且在此温度范围冬凌草甲素的浸出率亦相对较高，因此，应选择70 ～80 ℃的温开水浸泡，而避免使用沸水浸泡。

表4 不同温度下冬凌草茶中冬凌草甲素的浸出率Table 4 The extracting rate of oridonin in Rabdosia rubescens tea at different temperatures

4 结束语

冬凌草常作为茶饮用，可用于防癌及治疗咽炎等，茶以水为溶媒，因此冬凌草茶中的成分应具有较大的极性，多为多糖和黄酮类成分，因此本实验测定了冬凌草茶中的多糖及黄酮成分，该类成分多具有保健功能，而防癌与治疗咽炎等与冬凌草中的另一成分冬凌草甲素相关。近年来研究冬凌草甲素非常活跃主要是因其显著的抗癌活性，也是冬凌草中的代表成分。本实验同时测定了冬凌草茶中的冬凌草甲素浸出率，为揭示冬凌草茶的药理作用的物质基础提供依据。另外本实验还研究了不同温度对冬凌草浸泡出的茶中成分量的影响，结果显示：冬凌草茶中多糖及总黄酮随着浸提温度的升高，浸出率成升高趋势，而冬凌草甲素则呈相反的趋势且变化较小。多糖浸出率由0.81 %升至2.30 %，总黄酮浸出率由1.73 %升至4.21 %；冬凌草甲素的浸出率50 ℃浸出率为0.0661 %，而100 ℃浸出率为0.052 7%。鉴于饮用冬凌草茶的目的多为防癌、抗炎及调节免疫力等，要综合考虑这三种成分在茶中的浸出率，实验结果发现70～80 ℃范围内浸泡，能较好地兼顾这些成分。因此，应用冬凌草茶应避免选择沸水浸泡，尽量使用70～80 ℃温水浸泡。

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