油菜黄籽形成的分子机制研究

2015-12-06刘忠松官春云严明理刘显军

作物研究 2015年6期

关键词：花色素甘蓝型芥菜

刘忠松，官春云，严明理，刘显军，陆赢

（湖南农业大学油料作物研究所，长沙410128）

油菜黄籽形成的分子机制研究

刘忠松，官春云，严明理，刘显军，陆赢

（湖南农业大学油料作物研究所，长沙410128）

利用自然突变的遗传稳定黄籽材料，并且培育遗传背景相同的近等基因系，将种子的种皮和胚分离，从种皮颜色的决定物质研究入手，运用组织化学、遗传学、群体基因组学的方法，对油菜黄籽形成的分子机制和起源驯化进行了深入、系统研究，发现原花色素在油菜种皮中积累决定种皮颜色，油菜黄籽源于调控原花色素合成的转录因子基因TT8突变，致使DFR等基因不能被激活转录，从而不能催化原花色素生物合成底物的形成，原花色素合成需要的乙酰辅酶A被用于油的合成，减少种皮厚度，提高种子含油量。芥菜型油菜黄籽是在芥菜型油菜成种后在中国人工选择驯化的产物。创建了基于苗期黄籽基因型选择+种子发育早期香草醛染色观察的甘蓝型油菜黄籽高油分芥甘种间杂交育种体系，并成功用于育种实践。

油菜；黄籽；种皮颜色；基因克隆；驯化；育种

油菜种子是由胚珠受精后发育而成，包括胚、胚乳和种皮三部分，其中胚由母本的卵细胞与父本的精细胞结合所形成的合子发育而成，而种皮只由母体组织珠被发育而成，因而具有与母体植株相同的基因型。发育中的油菜种子由于含有叶绿素，种子外观呈绿色；随着种子成熟，种皮颜色改变，成熟的油菜种子有黑色、红褐色和黄色等类型（图1A，封三）。黑色、红褐色种子（黑籽、褐籽）的种皮中积累大量色素，而黄色种子（黄籽）的种皮不积累色素，是透明的，因而黄籽呈现的颜色是胚的颜色（图1B，封三）。

油菜黄籽比黑籽休眠短、易萌发、含油量高，已被国内外许多研究者所证实。笔者2010年将100份芥菜型油菜种质资源种植于兰州和昆明，考察其种皮颜色，并测定其种子含油量，发现52份黄籽材料平均含油量为36.41%，变幅为28.62%～43.96%，48份黑褐籽材料平均含油量为32.55%，变幅为24.46%～39.81%，两者差异极显著，平均含油量相差近4个百分点（未发表）。因此，国内外都把培育黄籽油菜品种作为油菜高油分育种的一条重要途径。

尽管油菜黄籽是提高含油量的重要途径，通过甘白、芥甘杂交等育种方法也选育出了一些黄籽油菜品种应用于生产，但直到21世纪初，对于油菜黄籽形成的认识还停留在性状遗传上。受拟南芥透明种皮（Transparent Testa，TT）研究的启发，利用天然突变、稳定遗传的芥菜型油菜黄籽种质作为材料，笔者开始油菜黄籽形成的分子机制探索。在国家自然科学基金、教育部科技项目的连续资助下，经过15年的研究，目前已经阐明了油菜决定种皮颜色的物质，图位克隆了芥菜型油菜控制种皮颜色的基因，揭示了种皮颜色基因调控黄籽形成过程，分析了种皮颜色基因的等位变异和黄籽的起源，创建了基于苗期黄籽基因型选择+种子发育早期香草醛染色观察的甘蓝型油菜黄籽高油分芥甘种间杂交育种体系，并成功用于育种实践。

1　油菜决定种皮颜色的色素物质

油菜在授粉后30～40 d内，黄籽和黑籽品种的种皮颜色无明显差别，均为绿色。但种皮的化学组成不一样，在授粉后10～15 d，决定种皮颜色形成的物质已经开始合成。

前人采用光谱技术进行了定量比较分析，认为油菜种皮中含有花色素、类黄酮、木质素、黑色素以及酚类等发色和助色物质［1，2］。但由于技术本身的限制，这些研究并未能确定是上述哪种或哪些物质决定了种皮颜色。

油菜种子中酚类物质含量高，通过光谱分析，发现芥菜型油菜黄、黑籽种皮的多酚含量接近（黄籽种皮的多酚含量约为黑籽种皮的90%［3，4］），显著区别于甘蓝型油菜的10%［5］。在此基础上，我们进行了香草醛试验和物质特征吸收峰分析等定性研究。香草醛染色试验表明，黑籽种皮与香草醛反应呈红色，而黄籽种皮没有该特征色。红色是黄烷醇类的3，4位酚羟基与香草醛发生羟醛缩合反应所致，推测黑籽种皮多酚应含在C环上有3-OH结构的儿茶素类黄烷醇分子。加入NaOH、AlCl3、NaAC+H3BO3等位移试剂后特征吸收峰分析表明，黄籽种皮中的黄酮醇类分子骨架A环上可能主要是单酚羟基，而黑籽种皮黄酮醇类分子骨架A环上可能主要是邻二酚羟基，具有邻二酚羟基黄酮醇可缩合成原花色素，这可能是黑籽种皮中的原花色素含量显著高于黄籽种皮的主要原因［3］。进一步将四川黄籽及其褐籽近等基因系NILA和NILB以及供体亲本紫叶芥的种皮和胚分开后，用香草醛和DMACA（专一与黄烷-3，4-二羟基醇和黄烷-4-羟基醇结合的试剂）染色，发现不论黄籽还是黑籽，胚都能被香草醛和DMACA分别染成红色和蓝色，但种皮不同，黄籽种皮用香草醛和DMACA都不能染色，说明黄籽种皮不含有黄烷3，4-二羟基醇和黄烷4-羟基醇，不能合成积累原花色素（图1B，封三）［6］。

用香草醛和盐酸-正丁醇染色法观察了四川黄籽、NILA、NILB和紫叶芥种子不同发育时期的种皮中原花色素积累动态，结果进一步证实原花色素是芥菜型油菜种皮颜色的决定物质，观察芥菜型油菜黄、黑褐籽材料各19份和甘蓝型油菜黄、黑籽各6份，结果显示原花色素是这些油菜种皮颜色的决定物质［7］。

原花色素是决定油菜种皮颜色的主要物质，为后来的质谱分析所证实［8～10］，原花色素仅存在种皮［11］。

2　油菜种皮颜色的调控基因克隆

前人多数研究认为芥菜型油菜黄籽性状是由2对隐性重叠基因控制，个别研究认为是由2个显性上位互作基因控制或单个隐性基因控制［12，13］。2个基因位点处于不同连锁群上，并找到了连锁的分子标记［14～17］。

在此基础上，我们构建了四川黄籽与紫叶芥高代回交单基因分离群体，建立分子标记与种皮颜色基因连锁分析的分析模型，进行基因定位和比较作图分析，结果将芥菜型油菜种皮颜色基因位点所在的2个连锁群分别对应于A09和B03染色体，并将A09染色体黄籽基因锁定在0.9 cM区间内［18～20］。

由于A基因组的基因信息资源较多，笔者利用已公布的白菜基因组序列、韩国白菜BAC序列开发标记和芸薹属植物A09连锁群已定位标记共316个标记进行筛选，发现其中31个标记与芥菜型油菜A09染色体控制种皮颜色的基因连锁，S88-Ⅳ-2、H032N11-2和S121-Ⅰ-2为共分离标记。利用共分离标记筛选构建的作图群体亲本紫叶芥的BAC文库（ZBjuH BAC文库），阳性BAC末端测序，进一步开发了46对引物，分析发现12个连锁标记。利用这些标记对由5 434株植株组成的BC8F2群体进行精细定位，结果表明芥菜型油菜BAC末端序列标记68N6和132O01R也与黄籽基因共分离，侧翼标记S134-16和S102-5相距都为0.04 cM。利用共分离标记和侧翼标记筛选ZBjuH BAC文库，构建了由11个BACs组成的A09染色体黄籽基因区域BAC重叠群［21］。将这些BACs进行全长测序、序列组装和功能注释，发现这个长约1.05 Mb的BAC重叠群编码66个基因，其中Gene_24为拟南芥基因At4g09820（TT8）的同源基因。该基因是在类黄酮生物合成途径中起调控作用的转录因子基因，因此推测该基因为黄籽候选基因。利用该候选基因的序列设计引物对BjuT8U4，扩增作图群体的黑籽亲本紫叶芥和黄籽亲本四川黄籽的目的基因，结果各有2个拷贝，分别命名为BjuA.TT8和BjuB.TT8，其中BjuA.TT8基因核苷酸序列在黄、黑籽亲本间不仅有SNP位点多态性，而且在黄籽亲本中BjuA.TT8外显子7有一段长为1 275 bp的序列插入，而BjuB.TT8基因的序列在黄、黑籽亲本间仅在外显子7有一个C-T转换［22］。

由于B基因组的基因信息资源较少，为了能开发定位标记，笔者对四川黄籽及其近等基因系种皮RNA测序（RNA-seq）组装的unigenes进行了分析。理论上由于四川黄籽与其B03染色体BC8F5代褐籽近等基因系NILB只有与控制种皮颜色的基因紧密连锁的基因存在序列差异，其他基因都与四川黄籽相同。分析结果表明，465个unigenes存在序列差别。利用有删除插入（InDel）的unigenes开发引物10个，筛选ZBjuH BAC文库，获得由2个BACs组成的重叠群。将BACs进行全长测序、序列组装和功能注释后，发现这个长约0.25 Mb的BAC重叠群编码12个基因，其中一个又是At4g09820的同源基因（未发表结果），其序列与由BjuT8U4引物对从紫叶芥中扩增获得的BjuB.TT8基因序列一致。

上述研究结果与之前（2009）关于油菜种皮颜色调控基因的本质是转录因子基因［20］的推测一致。2011年笔者在第13届国际油菜大会上初步报道了这些研究结果［23］。2013年印度Padmaja等人［24］报道了同样结果，不过他们的黄籽BjuA.TT8基因的插入片段为1 279 bp，经核实是他们的序列存在测序错误。

3　油菜黄籽形成的分子机制

油菜黄籽的种皮不合成积累原花色素，黄籽亲本的调控原花色素合成的转录因子基因Bju.TT8发生了突变，突变的Bju.TT8基因怎么导致了种皮中原花色素的合成积累受阻？笔者于2008年首先采用同源克隆方法从芥菜型油菜中克隆了原花色素生物合成途径的4-二氢黄酮醇还原酶（DFR）基因，通过RT-PCR研究其表达，结果发现DFR基因在芥菜型油菜紫叶芥和黑籽近等基因系的叶片、胚和种皮中都表达，在四川黄籽中只在叶片和胚中表达，但在种皮中不表达，并提出DFR基因在黄籽种皮中不表达导致种皮中原花色素不能合成，从而种皮透明，形成黄籽［25］。采用同样的方法，证明花色素合成酶（ANS）基因也具有相同的表达模式，在黄籽种皮中不表达［6］。这些结果后来被芯片分析和RNA -seq进一步证实。四川黄籽及其褐籽近等基因系NILA、NILB授粉后15 d种皮RNA-seq分析，发现分别有1 304个和1 273个差异表达基因，其中包括类黄酮合成途径基因（图2）［26］。

在四川黄籽种皮中发现的DFR、ANS基因不表达现象，是否也在其他黄籽材料中存在呢？分析Varuna（印度品种）、藏油1号等另外3个黑籽品种和努西纳（俄罗斯品种）、会理高足黄油菜（四川地方品种）等另外6个黄籽材料种皮中DFR、ANS等基因的表达，证实了在所有黄籽材料的种皮中原花色素合成途径基因都不表达。Akhov等在甘蓝型油菜中也证实黄籽是DFR酶活性降低所致［8］。

黄籽种皮中原花色素合成途径基因不表达，是这些基因本身突变的结果还是受其他基因调控的结果？为了回答这一问题，笔者克隆了紫叶芥、四川黄籽中的19个原花色素合成途径已知基因的61个拷贝并进行比较，发现在黄、黑籽材料之间DFR、ANS、 BAN等基因在外显子序列和启动子序列上没有差异［25，27～32］，说明DFR、ANS、BAN等基因在黄籽种皮中不表达是受其他基因调控的结果。

在油菜近缘植物拟南芥中DFR、ANS、BAN等基因在种皮中的表达受TT2（MYB转录因子）、TT8（bHLH转录因子）、TTG1（WD40蛋白质）组成的复合体MBW的调控。紫叶芥、四川黄籽及其近等基因系的TTG1、TT2基因在基因序列和表达量上都没有差异。正如前述，TT8基因在基因序列上存在插入和碱基转换，但其表达量如何呢？笔者进行了两个试验。一是将RT-PCR产物电泳分析和用限制酶进行酶切分析，结果表明四川黄籽及其近等基因系种皮中Bju.TT8基因都表达。二是比较RNA-seq中Bju.TT8在黄、黑籽种皮中的转录本数量，并用qRT-PCR验证，结果表明表达量没有差别［22，26，27，30］。黄籽材料Bju.TT8基因虽然突变，但在种皮中仍然表达，这种突变基因的表达蛋白为什么不能激活原花色素合成途径DFR、ANS、BAN等基因的表达？笔者克隆、分析了DFR、ANS、BAN等基因的启动子，采用酵母单杂交试验，检测野生型和突变Bju.TT8蛋白与DFR、ANS、BAN基因的启动子的互作情况，结果表明野生型Bju.TT8蛋白能与DFR、ANS和BAN基因启动子结合，但突变BjuA.TT8蛋白不能与DFR、ANS和BAN基因启动子结合，突变BjuB.TT8蛋白不能与DFR基因启动子结合，说明组成MBW复合体的Bju.TT8基因突变导致不能激活DFR等基因转录［33］。

由于黄籽种皮中DFR等基因不能转录，导致原花色素生物合成上游基因查尔酮合成酶（CHS／TT4）和下游谷胱甘肽转移酶（TT19）基因表达下调［22］，影响种皮中包括原花色素、木质素和芥子碱三类次生产物在内的类黄酮代谢。

4　芥菜型油菜黄籽的起源与驯化

芥菜型油菜起源于亚洲，但起源于亚洲何地尚存争议［34］。笔者从黄籽基因等位性入手，将四川黄籽、273-1（西藏野生材料）、努西纳、Cutlass（加拿大品种）等12个品种分成2组进行双列杂交，观察杂种F1植株上种子的颜色，结果所有杂种F1植株均结黄籽，说明这些材料黄籽基因是等位的［20］。对Varuna、Brown Mustard（加拿大品种）等8份黑籽材料和会理高足黄油菜、努西纳、Cutlass、Domo（加拿大品种）等14份黄籽材料用17个与种皮颜色基因连锁标记进行关联分析，结果表明所有黄籽材料在种皮颜色基因位点区域都具有相同的标记基因型（单倍型）［20］，而黑籽材料这些区段发生了广泛重组，表明中国、俄罗斯、加拿大、印度和巴基斯坦的芥菜型油菜黄籽资源在黄籽调控基因位点附近具有高度相同的基因型，由此提出芥菜型油菜黄籽材料在进化过程中是单一起源。克隆获得黄籽调控基因后，笔者从美国、德国、韩国等国家种质库征集包括芥菜型油菜在内的芥菜4个亚种的种质约500份，选择其中来自全球33个国家196份材料自交纯化（S2～S6代）后，利用基因特异引物扩增Bju.TT8基因，扩增产物电泳和测序，结果发现BjuA.TT8基因除了紫叶芥、四川黄籽所具有的2个等位基因外，还发现另外3个新的等位基因（其中1个删除突变，2个插入突变），而BjuB.TT8基因只有紫叶芥、四川黄籽所具有的2个等位基因，在黑籽材料中BjuA.TT8基因或BjuB.TT8基因可能单个突变，但没有发现同时突变的材料［33］。芥菜分为4个亚种［35］，根用（ssp.napiformis）、茎用（ssp.tsatsai）材料中没有发现突变等位基因，叶用（ssp.integrifolia）材料中发现有BjuA.TT8基因或BjuB.TT8基因突变等位基因材料，但没有发现同时突变的材料，籽用（ssp.juncea）材料中发现有 BjuA.TT8基因或BjuB.TT8基因突变等位基因材料，也发现同时突变的材料即黄籽材料（图3）。自然界出现了3种黄籽单倍型（表1），但只有一种单倍型即BjuA.TT8基因1 275 bp插入的黄籽类型广泛分布，在所分析的78份黄籽材料中有73份为这一类型，占93%，俄罗斯、加拿大、波兰、德国、丹麦、澳大利亚、印度、巴基斯坦等国家的黄籽材料只有这种类型。

图3　芥菜型油菜黄籽的起源

表1　黄籽等位基因在芥菜亚种的分布

据文献记载，中国芥菜经过尼泊尔传到印度，在9世纪前传到日本，18世纪末经东（黑龙江）、西（新疆）两条途径引种到前苏联、东欧国家，大约1860年输入英国，1936年到达北美，然后由英国传播到西欧和澳大利亚，加拿大的芥菜型油菜分别从英国、前苏联和中国引种而来［36～43］。芥菜型黄籽油菜起源于东方，中国—东欧类型芥菜型油菜既有黑籽、褐籽种质，也有大量的黄籽种质（约占种质的50%），但印度—巴基斯坦类型芥菜型油菜只有黑籽、褐籽种质，没有黄籽种质［37］，在北美把黑褐籽芥菜型油菜叫做印度芥菜（Indian mustard），而把黄籽芥菜型油菜叫做东方芥菜（Orientalmustard），据此可推测芥菜型油菜黄籽起源于中国。白菜型油菜天然黄籽也是TT8基因突变所致，黄籽的BraA.TT8基因在内含子2插入了一段4 320 bp长的Helitron转座子片段［44］，与芥菜型油菜黄籽Bju.TT8基因的外显子7突变位置不同，说明芥菜型油菜黄籽突变Bju.TT8基因并非来自其祖先种白菜型油菜，黄籽性状是芥菜成种后人工选择驯化的结果。中国在公元前6世纪已有芥菜的记载，周朝时已利用芥菜籽作调味品［45］，黄籽类型只出现在利用早的籽用材料中，而没有出现在利用迟的叶用芥（6世纪开始利用）、根用芥（16世纪）和茎用芥（18世纪），说明芥菜型黄籽油菜驯化时间早，与用途有关。

5　油菜黄籽高含油的机制

将四川黄籽及其近等基因系夏季种植于昆明，从授粉后15～40 d种子每隔5 d收获种子，测定千粒重、含油量以及种皮原花色素、木质素含量，结果表明，尽管黄籽亲本与2个褐籽近等基因系的千粒重没有显著差异，但黄籽亲本的油分积累速率从授粉后25 d显著快于褐籽近等基因系，与此同时近等基因系种皮中的原花色素和木质素加快合成积累，而黄籽亲本种皮中的原花色素和木质素保持低水平（图4）［46］。这说明种子中油的合成积累与种皮中原花色素和木质素合成积累存在竞争关系，与油脂、原花色素和木质素的合成都需要共同的底物乙酰辅酶A是一致的，与四川黄籽种皮薄（多年测定皮壳率为10%～12%）、褐籽近等基因系种皮厚（多年测定皮壳率为14% ～16%）也是一致的。

图4　授粉后黄籽亲本（SY）与2个褐籽近等基因系（NILA、NILB）的千粒重、含油量、种皮原花色素和木质素含量变化

6　油菜黄籽高油分育种方法创建

甘蓝型油菜是油菜的主栽类型，但没有天然的黄籽材料。选育甘蓝型黄籽油菜品种，多通过与白菜型油菜、芥菜型油菜等近缘种的黄籽材料杂交，将黄籽性状基因导入甘蓝型油菜中。同白菜型油菜一样，芥菜型油菜2个黄籽调控基因一个在A09染色体（BjuA09.TT8），另一个在B03染色体（BjuB03.TT8），异源四倍体的芥菜型油菜和甘蓝型油菜分别具有AABB和AACC染色体组，BjuA09.TT8可通过同源重组由芥菜型油菜转移到甘蓝型油菜。但BjuB03.TT8如何转移到甘蓝型油菜、转移到甘蓝型油菜基因组哪里，还面临两个问题:一是芥甘杂交后代，由于B组染色体不能配对［47，48］，包括B03染色体在内的B组染色体在后代中可能丢失，如何防止BjuB03.TT8丢失？二是甘蓝型油菜也有2个TT8基因，分别位于A09和C09染色体上即BnaA09.TT8（BnaA09g22810D）和BnaC09.TT8（BnaC09g24870D）［49］，在芥甘杂种后代中它们尤其是BnaC09.TT8能否成功替代或淘汰？再者，黄籽是隐性性状，且种皮颜色要等种子成熟时才能考察，能不能在种子发育早期甚至或苗期就进行黄籽性状选择？

在克隆油菜黄籽调控基因、揭示种皮颜色的决定物质后，笔者创建了基于苗期黄籽基因型选择+种子发育早期香草醛染色观察的甘蓝型油菜黄籽高油分芥甘种间杂交育种体系。具体做法:（1）芥甘杂交早期世代如BC1F1和BC1F2的育性低，需要用甘蓝型油菜回交，难以获得大量种子，不能考察种皮颜色，且后代分离大［50，51］，来自芥菜型黄籽油菜的突变基因和来自甘蓝型黑籽油菜的TT8都存在于杂种后代中，在苗期采用TT8基因特异标记跟踪BjuA09.TT8和BjuB03.TT8突变基因，选留具有2个突变基因的后代植株，实施DNA标记辅助前景基因型选择。（2）对芥甘杂交中期世代，在前景基因型选择的基础上，对选留植株在开花授粉后15 d用0.5%香草醛将种皮染色5 min，选留不染色的植株，淘汰染红的植株，由于油菜花期长达25～35 d，因而可以对选留植株后面开放的花朵进行育种处理，使得对黄籽性状的表型选择能提早一代进行［7］。（3）对芥甘杂交已育成的黄籽株系，利用与黄籽基因连锁分子标记和不连锁分子标记分别进行重组体选择和背景基因型选择［52，53］，加快向甘蓝型油菜回复的速度，进一步缩短育种周期。

应用基于苗期黄籽基因型+种子发育早期香草醛染色观察的甘蓝型油菜黄籽高油分芥甘种间杂交育种方法，笔者利用芥菜型黄籽品种四川黄籽与甘蓝型黑籽油菜株系1047杂交，杂种F1与加拿大甘蓝型春油菜低亚麻酸品种Stellar杂交，成功选育出甘蓝型纯黄籽高油分新品系“黄矮早”［54，55］。这种黄籽新品系黄籽性状稳定，100%植株黄籽，经农业部油料及制品质量监督检验测试中心连续2年检测，含油量稳定在50%以上，最高达到52.38%，SSR（简单重复序列）标记分析和基因组重测序表明存在来自四川黄籽的染色体片段导入。

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