陈余娟

(四川大学生物治疗国家重点实验室 四川成都 610100)

mrc-5细胞是来源于一个27岁的健康妇女(瑞典)的14周男性胚胎,该细胞核型为46XY,衰老期为48群体倍增代。MRC-5原始种子库为7代细胞,共481支。2005年该委员会向WHO建议并被批准建立了新的细胞库,细胞代次为12代。MRC-5细胞株是世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐的可以用于人用疫苗生产的标准人二倍体细胞株,其免疫原性好,具有良好的耐受性,无异种移植致癌性,无外源因子污染,其规模化培养适宜生产多种病毒性疫苗。到目前为止,mrc-5细胞被世界各地很多疫苗生产厂家用于疫苗生产,比如人二倍体细胞狂犬疫苗(HDCV)。

1 材料

1.1 生物反应器

中国广州奇志公司生产的BC-15L(工作体积12L)以及BC-100L型(工作体积80L)微载体培养系统。

1.2 细胞

中国成都康华生物制品有限公司MRC-5工作细胞库细胞,23代。

1.3 微载体

GE公司的cytodex I 型,按照厂家指导进行制备和灭菌处理,使用浓度5g/l-15g/l。

1.4 培养液

日本株式会社的MEM培养液,补加10%的小牛血清(山西太原润生),0.03%L-谷氨酰胺,1%非必须氨基酸(Gbico)。

1.5 消化液

0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液。

1.6 细胞洗涤液

pH7.2 0.01mol/l PBS溶液

2 方法

2.1 mrc-5细胞的准备

将MRC-5细胞复苏,并在2000ml K氏瓶中培养扩增,培养条件为pH7.2—7.4、36-37℃、3%-5%CO2、待细胞长成致密单层后,消化、收集细胞悬液。

2.2 微载体培养mrc-5细胞

2.2.1 微载体处理

cytodex I型微载体,按照GE公司说明将微载体用pH7.2 0.01mol/LPBS水化膨胀,高压灭菌,用培养液置换1-2次后,浸泡2小时以上,备用。

2.2.2 细胞接种

将细胞悬液接种到BC-15L细胞培养罐内,接种密度(1×105个/ml),培养浓度5g/L。设置好培养参数(温度37℃,pH7.2,DO50%,转速40rpm)进行培养,每天更换营养液,细胞在微载体上长满单层后可进行二级放大。

图2

2.2.3 微载体培养二级放大

种子罐细胞长满后,用PBS洗涤细胞三次,加入0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶溶液(30ml/g)消化细胞,转速150rpm,消化5、10、15、20分钟后取样观察细胞状态并测定细胞活力,细胞从载体上脱离下来后,按比例将细胞悬液转入到BC-100L细胞培养罐扩增,设置好培养参数进行培养。

2.3 台盼蓝染色法计细胞密度和活力

健康的细胞能够排斥台盼蓝,而死亡细胞被台盼蓝染成蓝色,依据此原理可通过血球计数板在显微镜下直接计数,来判断细胞的存活率。

3 结果

消化cytodex1上的细胞,5min,10min,15min,20min时取样观察细胞消化状态并拍照,测定细胞活力（图1）。

加入消化液后,高速搅拌使消化液均匀作用于每个微载体上的细胞,同时也对微载体上的细胞产生剪切力,至细胞损伤,降低细胞的活力,所以选择一个可接受的消化状态对微载体的二级放大是非常重要的,因为如果载体上的细胞未完全脱落时,或是细胞成团状而未成单个细胞悬液时,又或是细胞消化过度活力降低时都会影响细胞的再次贴壁和培养。

从上图我们可以发现,当加入消化液5min微载体大多聚集在一起,成团状,细胞有回缩现象,仅少数细胞脱离载体,处理10min,载体上80%的细胞已经脱落,细胞活力95%,处理15min,细胞95%从微载体上脱落,且形成单个分散的悬液,细胞活力92%,处理20min,细胞完全脱离微载体,此时的细胞活力为85%。因此,选择0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶消化液作用15min作为mrc-5细胞微载体消化的最佳时间。

4 讨论

生物反应器微载体培养过程从实验室规模放大到中试甚至于工业化生产规模的过程中,如何有效的放大一直是生产中的难点(1)。有报道研究是在微载体培养过程中直接将上一级培养物(长满细胞的微载体)作为种子接入到下一级生物反应器中,通过在旧球和新球的重新分配而实现扩大培养(2),这种培养方法的优点在于操作简单,污染机会小,微载体利用率高,可以连续使用,但是新旧载体上的细胞处于不同的生长状态,最终旧载体上长满细胞而新载体尚未长满,空球率高,细胞生长没有明显的对数生长期,这反应了细胞群体中细胞的生理状态有明显的差别,细胞代次不一致,不符合于药品生产的要求。试验结果表明使用0.01%EDTA-0.25%胰蛋白酶消化液在BC-15L生物反应器内150rpm,消化10-15钟可获得活力高且分散均匀的mrc-5细胞悬液。

[1] Kunitake R,Suzuki A,Lchihashi H,et al.Fully-automated roller bottle handling system for large scale culture of mammalian cells(j).J Biotechonology,1997,52(6):289-191.

[2] Wang Y.Quyang F.Bead-to-bead transfer of Vero cells in microcarrier cultrure(J).Cytotechology,1999,31(31):221-224.