胡松梅

摘    要：以铁皮石斛抗寒品种茎段为外植体，运用组织培养技术建立铁皮石斛无性快繁体系，筛选出铁皮石斛快繁的最佳培养基。结果显示，以铁皮石斛茎段为外植体诱导原球茎，最佳诱导培养基为MS + 6-BA 2 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 + IBA 0.2 mg·L-1，诱导率为66.67%。原球茎最佳分化培养基为MS + 6-BA 0.5mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 + IBA 0.1 mg·L-1 ，苗整齐健壮，叶片大而浓绿。试管苗生根的最佳培养基为1/2 MS + IBA 0.2 mg·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1，生根率为100%。驯化移栽基质为碎砖瓦15%+松树皮50%+刨花25%+羊屎10% 。

关键词：铁皮石斛;快速繁殖;最佳培养基

中图分类号：S567.23+9                   文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.026

Rapid Propagation of  Dendrobium officinale Kimura et Migo

HU Song-mei

（Loudi Vocational and Technical College， Loudi， Hunan  417000 ，China）

Abstract： Using tender stem as explant，tissue culture and plant regeneration of Dendrobium officinale Kimura et Migo have been studied. The results indicated that the protocorm could be induced from tender stem， and differentiated to regeneration plants in the proper medium. The most appropriate medium for the induction was MS + 6-BA 2 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 + + IBA 0.2 mg·L-1 and the most appropriate medium for the differentiation of protocorm was MS + 6-BA0.5 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1  + IBA0.1 mg·L-1 .  In addition， the optimum medium for rooting was 1/2MS + IBA0.2 mg·L-1 + NAA0.3 mg·L-1. The inducing percentage of protocorm reached 66.67%and the rooting rate reached 100%.The resulted also showed that the optimum culture medium was broken tiles 15% + pine bark50% + wood shavings25% + goat dung 10%.

Key words： Dendrobium officinale Kimura et Migo; rapid propagation; proper medium

铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物[1]，史称“中华九大仙草之首”，具有抗衰老、抗肿瘤、增强机体免疫力和扩张血管等作用，在临床与中药复方中被广泛应用[2]。野生铁皮石斛主要在云南、浙江、广东、广西等地[3]，在湖南省新宁县也有分布。铁皮石斛对生境要求苛刻，一般生长在高温多湿的热带、亚热带的高山峻岭、悬崖峭壁及岩石缝隙之间，生长速度缓慢、自然繁殖力极低。通过组织培养快速繁殖铁皮石斛是解决种苗缺乏的有效途径[4]。

1 材料和方法

1.1 材 料

本试验用铁皮石斛引种自浙江雁荡山，采用DES诱变与离体培养低温胁迫相结合筛选出抗寒品种，将抗寒品种栽种于湖南省湘乡县试验基地。

1.2 方 法

取铁皮石斛母株1年生茎段为外植体，去叶后放入低浓度的洗衣粉水中漂洗3～5 min，用流水冲洗1 h。在超静工作台内，用75%酒精浸泡30 s，放入0.1%的HgCl2溶液灭菌8 min，无菌水冲洗5～6次。将消毒好的茎段切段长约1.5～2 cm，接种于原球茎诱导培养基，40 d时记录诱导率。将原球茎增殖3次后转接到分化培养基中，40 d时记录分化率。选取高1 cm以上、长势较一致的壮苗，转入1/2 MS 生根培养基中诱导生根，40 d后观察统计苗的生根率、平均生根数和生长状况。将有3～4个节间、根长在3 cm以上的铁皮石斛试管苗移入栽培基质中，40 d后统计成活率。

原球茎诱导、增殖和分化基本培养基为MS，生根基本培养基为1/2 MS，所有培养基均附加10%香蕉汁、蔗糖 30 g·L-1 ，琼脂7 g·L-1 ， pH值 5.8，培养温度为24～28 ℃，光照时间为 16 h·d-1，光照强度为2 000 lx 。

在不同培养基中添加不同激素，各处理的浓度设计分别如下（单位为mg·L-1 ，以下皆同）。

原球茎的诱导培养基分为4个处理组合：① 6-BA 3 +NAA 1+ IBA 0.2;② 6-BA 2 + NAA 0.5 + IBA 0.2;③ 6-BA1.5 + NAA 0.2 + IBA 0.2;④ 6-BA 1 + NAA 0.2 + IBA 0.2。

原球茎的继代培养基分为3个处理组合：① 6-BA 2 + NAA 0.2;② 6-BA 1 + NAA 0.2;③ 6-BA 0.5 + NAA 0.2。

原球茎的分化培养基分为3个处理组合：① 6-BA 2 + NAA 0.2 + IBA0.1+多效唑1;② 6-BA 1 + NAA 0.2 + IBA 0.1+多效唑1;③ 6-BA 0.5 + NAA 0.2 + IBA0.1+多效唑1;④ 6-BA 0.5 + NAA 0.2 + IBA 0.1。

生根培养基为3个处理组合：① IBA0.5+ NAA 0.5;② IBA0.2+ NAA 0.3;③ IBA0.1+ NAA 0.2。

驯化移栽基质为3个处理组合：① 碎砖瓦25%+松树皮50%+刨花15%+羊屎10%;② 碎砖瓦15%+松树皮50%+刨花25%+羊屎10%;③ 碎砖瓦5%+松树皮60%+刨花25%+羊屎10%。

2 结果与分析

2.1 不同激素组合对铁皮石斛原球茎诱导影响

以铁皮石斛茎段为外植体，将已灭菌的外植体接种于原球茎诱导培养基，采取不同浓度的6-BA和NAA+IBA 进行比较试验。不同激素组合对铁皮石斛原球茎诱导的影响见表1。

表1表明，含有6-BA和NAA+IBA的激素组合中均能诱导出原球茎，但6-BA浓度为1 mg·L-1时，诱导率急剧下降。相对高浓度的6-BA对诱导原球茎起着关键作用。①号培养基诱导出的原球茎呈淡绿色，玻璃化现象严重。分析其原因，认为细胞分裂素浓度过高时铁皮石斛原球茎易导致玻璃化，在继代增殖中生长速度快，分化时成苗率不高。③号和④号培养基诱导出的原球茎颜色鲜绿，生长状况良好。在此培养基中原球茎既可以大量增殖，又可以分化成芽，能实现一步成苗的目的。

试验结果表明，以铁皮石斛茎段为外植体诱导原球茎，最佳诱导培养基为MS + 6-BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 ，诱导率为66.67%。

2.2 不同激素组合对铁皮石斛原球茎继代培养的影响

在诱导出的原球茎中，挑选长势均一、生长状态良好、无分化、颜色嫩绿的进行继代增殖培养，增殖控制在10代以内。4种培养基均能使原球茎增殖。①号培养基中的原球茎呈淡绿色，玻璃化现象较严重，而且随着继代次数的增加，原球茎开始水渍化，玻璃化现象日益严重。③号培养基诱导出的原球茎颜色鲜绿，生长状况良好。但继代至5代以后，也会产生玻璃化，原因为6-BA有累积效应，故应逐步降低6-BA的含量，以减免原球茎的玻璃化。根据原球茎的生长状况调节6-BA的含量，最低使用量为0.2 mg·L-1。40～50 d继代1次，每次增殖倍数控制在7～8倍左右为宜。在③号培养基中如果继代时间过长，会形成分化，但分化苗不能整齐一致，影响生根培养。

试验结果表明，在5代之内，铁皮石斛原球茎继代培养最佳养基为MS + 6-BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1 。5代之后要逐步降低6-BA的含量。

2.3 不同激素组合对铁皮石斛原球茎分化影响

当原球茎达到一定量后接种于分化培养基的3个处理组合中，培养40 d，均能分化成苗。①、②号培养基既能使原球茎增殖，也能诱导它分化，但原球茎增殖大于分化。苗瘦弱，常有玻璃苗。③号培养基成苗率可达90%以上，原球茎增殖程度低，且苗健壮整齐，叶片大而浓绿，④号培养基与前三种培养基相比苗不整齐，每瓶苗中的分化苗差异显著，故在铁皮石斛原球茎分化中，添加适量的多效唑可促使分化苗整齐一致，这对提高生根培养的接种速度至关重要。

试验结果表明，③号培养基MS + 6-BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.2 mg·L-1  + IBA0.1 mg·L-1 + 多效挫1 mg·L-1 为铁皮石斛原球茎分化的最佳培养基。

2.4 不同激素组合对铁皮石斛试管苗生根影响

不同激素组合对铁皮石斛试管苗生根的影响见表2。

表2数据表明，铁皮石斛试管苗较易生根，生根率达100%，但生根数量少，平均为3～4根。①号培养基中高浓度的生长素会抑制植物的向上生长，从而导致铁皮石斛植株生长缓慢，节间缩短，延长了育苗时间，且移栽成活率相对较低。②号培养基生长素浓度适中，植株粗壮，生长迅速，根粗壮，移栽成活率相对较高。在②号培养基中添加1 mg·L-1的活性炭可以吸附有害物质，生根速度更快。

试验结果表明：铁皮石斛组培苗的最佳生根培养基为1/2 MS + NAA 0.3 mg·L-1 + IBA 0.2 mg·L-1，生根率为100%。在此培养基中培养20 d 左右试管苗开始生根，40 d 左右长出3～4 条长约 1.5 cm、粗约0.15 cm的白色肉质根。

2.5 试管苗的移栽驯化

试管驯化移栽前将瓶苗移至大棚炼苗3～5周，遮光率为70%，使试管苗茎段肥厚粗壮且茎干稍硬化。这样试管苗从恒温高湿的环境向开放变化的环境过渡，可以慢慢适应自然温湿度[5-8]。出瓶前，先将瓶盖打开并在室外放置，让其适应自然温湿度。2～3 d后将小苗轻轻取出，洗掉组培苗根部的琼脂，用800倍多菌灵药液浸泡10～15 min。将组培苗采取架空栽培的方式使用3种移栽基质进行试验。①、②、③号移栽基质的成活率分别为85.7%，96.2%，94.3%。①号基质保水性能较差，根部固定不牢固，喷灌易倒伏。②、③号基质成活率差异不显著，从生产成本考虑，故大规模移栽时选择②号移栽基质。

3 结论与讨论

铁皮石斛可通过原球茎和丛生芽进行增殖，茎段产生的丛生芽粗壮，成苗率高，移栽成活率也高，但增殖系数少。原球茎增殖系数高，但苗易玻璃化。

生根培养基中不放激素时移栽成活率相对较高，但培养时间相应延长。生根培养基中可添加5%～10%的土豆、红薯、香蕉汁，可促进壮苗，试管苗更健壮。

参考文献：

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（2005年版，一部）[M].北京：化学工业出版社，2005：62.

[2] 张贵君.中药鉴定学[M].北京：科学出版社，2002：9.

[3] 中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，2006（19）：117.

[4] 斯金平，诸燕，朱玉球.铁皮石斛人工栽培技术研究与应用进展[J].浙江林业科技，2009（6）： 66-70.

[5] 黄松，刘星华，刘宏源，等.铁皮石斛野生转家栽规范化种植（GAP）研究与产业化基地建设[J].世界科学技术：中医药现代化，2010（1）：125-139.

[6] 杨小兵，王增利，史昊，等.光强对悬浮培养下铁皮石斛原球茎生长的影响[J].河南农业科学，2014（1）：116-119.

[7] 侯甲男，王政，尚文倩，等.CCFL光源不同光质比对铁皮石斛原球茎增殖及试管苗生长的影响[J].河南农业科学，2013（1）：86-89，101.

[8] 袁正仿，张苏锋，远凌威.铁皮石斛高产优质栽培技术[J].河南农业科学，2004（2）：49.