梁海恬+何宗均+高贤彪+吴迪+李妍+李峰+赵琳娜+钱姗+王德芳+田阳

摘    要：采用常规分离方法对采集样品进行微生物分离，通过分析分离菌株对高岭土悬液的絮凝效果，筛选出4株具有高生物絮凝活性的菌株，其中菌株X1801的絮凝率可达98.56%。采用形态学特征、生理生化方法和16S rDNA基因序列比对方法对该菌株进行分析，鉴定该菌株为简单芽孢杆菌（Bacillus simplex），菌株应用于污水处理表现出较强絮凝活性。

关键词：农村污水;絮凝菌株;16S rDNA;絮凝特性

中图分类号：S224.21                  文献标识码：A             DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.006

Screening and Identification of Bio-flocculate Producing Strain for Rural Wastewater Treatment

LIANG Hai-tian， HE Zong-jun， GAO Xian-biao， WU Di， LI Yan， LI Feng， ZHAO Lin-na， QIAN Shan， WANG De-fang， TIAN Yang

（Tianjin Institute of Agricultural Resource and Environmental Science， Tianjin 300192，China）

Abstract： This study focus on the bacterial screened from different samples by means of common bacteria screening and purification method. Based on the effect of kaolin suspending liquid test， 4 strains were obtained. The flocculating rate of strain X1801 reached 98.56%. According to morphological characteristics， physiochemical test and 16S rDNA gene sequence analysis， strain X1801 was identified as Bacillus simplex， and it showed significant flocculation effect on the wastewater treatment.

Key words： rural wastewater;bio-flocculation strain;16S rDNA; flocculation characteristic

目前，我国城镇地区污水基本纳入下水管网，输送至大型污水处理厂进行集中处理，水处理的技术能力已达到一定水平，絮凝技术常作为重要的基本操作单元被广泛应用[1-3]。农村经济快速发展的同时，污水排放量也日益增加，由于这类污水经过处理后多排放至河流、湖泊等受纳水体中，因此，农村污水处理工艺的安全性是关系农村生态环境和食品安全的重要问题。生活污水处理主要分为好氧生物处理、厌氧生物处理和自然生物处理，在实际中为了提高处理效率，达到排放要求，常采用多种处理技术复合应用[4-5]，絮凝沉降法由于具有成本低、工艺简单、效果稳定等特点，在污水一级处理工艺中占有重要地位[6-9]。

由于无机絮凝剂和有机高分子絮凝剂在使用安全性方面存在一定问题，因此易降解、无二次污染的生物絮凝剂在污水处理工艺上的研究越来越受到关注[10-11]。生物絮凝剂是一类由微生物代谢产生的具有絮凝功能的高分子物质，对水体中的悬浮物、金属离子等具有一定的吸附作用。已有研究表明，微生物絮凝剂可以有效地应用于生活废水和工业污水的处理。例如苏晓梅等[12]研究发现，生物絮凝剂MAC37在黏合剂废水处理中具有较好的应用效果。Li O等[13]的研究表明，Paenibacillus etgii B69菌株产生的絮凝剂不仅对市政污水具有很好的絮凝澄清作用，对于染料废水、重金属污染也具有良好的去除作用，具有絮凝功能的微生物涵盖多种群，涉及细菌、真菌、放线菌等，其应用领域也日益广泛[14-16]。本研究从多种类型的采集样品中筛选出一株具有高絮凝活性的微生物菌株，并对其进行了鉴定和絮凝特性研究，为该菌株在水处理领域的进一步应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

菌种来源：试验菌株筛选自污水处理厂、菜园土等地的采集样品，经微生物富集、分离、培养、纯化及传代稳定性检验后得到菌株的纯培养物，实验室低温保藏。

分离培养基：葡萄糖10 g，K2HPO45 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，脲0.5 g，KH2PO4 2 g，NaCl 0.1 g，酵母膏0.5 g，蒸馏水1 000 mL， pH值7.5。

发酵培养基：葡萄糖20 g，（NH4）2SO4 2 g，KCl 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸馏水1 000 mL， pH值7.5。

所用试剂为国产分析纯，市售。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的筛选 絮凝菌株的初筛方法：采用平板梯度稀释法对新鲜样品进行分离，将梯度稀释后的菌液均匀涂布于分离培养基上进行恒温培养，挑取单菌落进行平板划线，以获得纯培养物。采用高岭土絮凝法对菌株进行絮凝效果初筛，观察各菌株是否具有形成絮状沉淀的特性。

絮凝菌株的复筛方法：对具有絮凝能力的分离菌株进行液体培养获得48 h发酵液，采用高岭土絮凝法进行絮凝效果测定，以高岭土悬浊液为空白对照，各处理静置10 min后，使用721型分光光度计测定上清液在550 nm处的OD值。选取絮凝效果好的菌株进行传代稳定性检验，低温保藏。

絮凝率的计算公式如下：

μ=[（A1-B1）/A1]×100%

其中，A1表示空白对照在550 nm处的吸光度OD550，A1表示菌发酵液在550 nm处的吸光度OD550，μ表示加入絮凝发酵液后水中悬浮物的去除率。

1.2.2 菌株的鉴定 （1）形态学观察。将纯培养物接种于三角瓶中，28 ℃培养24 h，涂布于平板培养基上，28 ℃培养48 h后观察菌落形态，采用革兰氏染色法进行菌体形态观察。

（2）生理生化测定。试验方法参照《常见细菌鉴定手册》进行 [17-18]，主要包括染色试验、细胞形态学观察、糖发酵试验、淀粉水解试验等。

（3）菌株。16S rDNA基因序列分析 采用TIANGEN试剂盒DP209对目标菌株进行基因组DNA提取，操作步骤依据试剂盒说明书。

提取基因组DNA后，对16S rDNA进行PCR扩增，所用引物为通用引物，正向引物PF 5-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3和反向引物PR 5 -AAG GAG GTG ATC CAR CCG CA-3。PCR反应体系总体积为50 μL：Premix 20 μL，引物各1 μL，模板DNA 2 μL，超纯水26 μL。PCR程序：95 ℃ 7 min;35循环（95 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s）;72 ℃ 10 min。PCR扩增结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳进行产物分析后，TIANGEN胶回收试剂盒对目标片段进行回收并测序。

将测序结果16S rDNA序列发送到NCBI数据库中进行BLAST搜索，选取相似度高的序列，采用邻接法构建系统发育树，确定菌种分类，构建系统发育树所用软件为MEGA5.05和Custal X。

1.2.3 絮凝菌对污水悬浮物指标（SS）的去除效果研究 取1环生长良好的絮凝菌株斜面培养物至装有250 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，28～30 ℃摇床150 r·min-1培养48 h，离心后获得上清生物絮凝剂。

采集污水样品，置于实验室小型絮凝反应器中，调节反应体系pH值至8.0，将生物絮凝剂按1%，3%，5%，7%，9%的比例加入反应器中，搅拌均匀后静置30 min测定反应器水样中的悬浮物指标（SS）。悬浮物指标（SS）的测定方法参考GB 11901-1989水质悬浮物的测定重量法。

2 结果与分析

2.1 絮凝高效菌株的筛选

对采集样品中的絮凝微生物进行初筛后，获得4株具有较高絮凝活性的菌株，采用高岭土絮凝法进行复筛。复筛结果表明（表1），絮凝效果较好的菌株Z2701、Z1902、X1801和X1806絮凝率分别为94.23%，96.54%，97.88%，98.56%，其中菌株X1801形成的絮状颗粒较大，絮凝沉降速率较快，稳定性好，本研究选取絮凝效果最好的菌株X1801进行菌株鉴定和絮凝特性研究。

2.2 菌株形态及生理生化试验结果

如图1所示，通过对分离得到的纯培养物进行平板涂布，观察到该菌株生长旺盛，好氧型。菌落形态为乳白色半透明状圆形菌落，表面突起，菌落边缘较为整齐，用接种环挑取菌落时感觉质地粘稠。

表2显示的是菌株的部分生理生化试验结果，对菌株进行革兰氏染色，显微镜观察菌体呈革兰氏阳性（G+），杆状细胞，有芽孢形成，菌体大小为0.3～1 μm×2.0 ～3 μ m，呈单个或V字型排列。菌株的部分生理生化试验结果见表2，该菌株为革兰氏阳性杆菌，细胞形状为杆状，细胞直径<1 μm，有芽孢，接触酶、淀粉水解、水解明胶均为阳性，厌氧生长阴性，甲基红试验阴性，β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶阴性， pH值5.7生长。

根据菌株的形态学及生理生化试验结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，初步判断该菌株的形态学特征和生理生化特征与芽孢杆菌属相近。

2.3 菌株16S rDNA基因序列分析

图2显示的是对絮凝菌株的目标片段进行PCR扩增后，采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检验，所用Marker为DL5000，获得大小约为1 400 bp左右的产物条带。对目标条带进行产物回收，测序结果显示该菌株的16S rDNA核苷酸序列长度为1 427 bp，将该序列在NCBI数据库中进行BLAST搜索，获得13条相似度较高的模式菌株16S rDNA序列。采用邻接法进行聚类分析和系统发育树构建，构建的系统发育树如图3所示。

试验结果表明，絮凝菌株X1801在发育树中位于芽孢杆菌属（Bacillus）分支中，系统分类支持率较高。并且与标准模式菌株Bacillus simplex的同源性高达92%，提示该絮凝菌株可能与菌株Bacillus simplex相似度较高，结合菌株的形态学特征及生理生化特征，该菌株鉴定为简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）。

2.4 对污水悬浮物指标（SS）的去除效果

使用实验室小型絮凝反应器对菌株X1801的生物絮凝效果进行研究，采集污水的初始悬浮物SS平均浓度为70.39 mg·L-1，分别按比例加入1%，3%，5%，7%，9%生物絮凝剂后，搅拌均匀后静置30 min取样进行测定，检测结果如图4所示，絮凝率分别为56.61%，62.54%，68.13%，69.23%和71.37%，处理后污水的悬浮物指标SS基本达到国家二级排放标准。

3 结论与讨论

（1）本研究从多种类型的采集样品中筛选到1株具有较高絮凝活性的微生物菌株X1801，对其絮凝特性进行了初步的研究，经形态学特征和生理生化试验，结合菌株16S rDNA基因序列分析，鉴定该菌株为简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）。絮凝菌株X1801在实验室小型絮凝反应器中应用试验表明，对污水SS具有较好的絮凝效果，处理后水中悬浮物指标基本达到国家排放标准，具有一定的应用前景。

（2）由于农村地区的污水排放具有分散，产量低等特点，收集处理的难度较大，现有农村污水几乎50%以上未经处理，直接排放至自然水体和土壤中，或直接进行农田回用。农村是种植、养殖业聚集地，具有食品生产转化功能，因此，农村地区的水安全问题更关乎食品安全问题，出水的安全性要求应更加严格。传统的无机絮凝剂和有机高分子絮凝剂所呈现的弊端更加明显，对水处理剂的安全性要求更高，因此，亟需开发适合农村污水处理的生物絮凝剂。本研究对象生物絮凝菌株X1801具有较高的絮凝活性，有利于开发出一种稳定的生物絮凝剂，用于农村污水处理。

（3）国内外有很多关于生物絮凝菌株研究的报道，但将简单芽孢杆菌应用农村污水处理生物絮凝工艺上的报道较少[19]，具有较好的应用转化前景。但由于微生物絮凝剂受到生产成本高、环境稳定性差等特点的制约，在实际应用中一直存在一定的瓶颈，因此，今后的研究应关注生物絮凝剂工业化生产工艺的研究。

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