马 琳，杨子祥，唐翊峰，刘 平

(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室，昆明 650224)

蚜虫属半翅目Hemiptera，蚜总科Aphidoidea，是一类植食性昆虫，目前已经报道约5000种(Blackman and Eastop，2013)，其中有400 多种能刺激植物组织增生，形成虫瘿(张合彩等，2006)。与其他大多数咀嚼式口器的昆虫不同，蚜虫为刺吸式口器，其口器特化为针状，内部包含两个管道，食物管道和唾液管道，其中食物管道将植物木质部或韧皮部筛状结构中营养丰富的汁液输送到蚜虫的消化系统，唾液管道则将蚜虫唾液注入植物组织，当蚜虫取食时，正是通过这两条管道实现昆虫与植物之间液体物质的交流(Miles，1999)。蚜虫大多数是害虫，如棉蚜Aphis gossypii、麦长管蚜Macrosiphum avenae、桃蚜Myzus persicae 等为重要的农林害虫;但少数种类对人类有益，如五倍子蚜是重要资源昆虫，由其寄生在盐肤木等植物上形成的虫瘿，称为五倍子，是重要的化工和医药原料，具有较高的经济价值。

蚜虫的唾液是蚜虫与植物相互作用的媒介，其主要成分是氨基酸和各种酶类，如果胶酶、多酚氧化酶、纤维素酶和淀粉酶等(Ma et al.，1998;Urbanska et al.，1998;Miles，1999)，在克服寄主植物的防御反应、帮助取食和消化、食物解毒等方面发挥着非常重要的作用(Miles and Peng，1989);蚜虫唾液中可能还含有特殊的活性物质，能够诱导植物组织异常增生形成虫瘿。因此，对蚜虫唾液的提取和成分分析，有助于深入理解唾液在诱导和克服植物抗性反应的机理、探索虫瘿形成的关键因子，对作物抗蚜品种选育、防治技术开发和虫瘿形成机理研究等具有重要意义。目前蚜虫唾液的研究方法主要是双层膜夹营养液法收集，经过浓缩及质谱(LC-MS/MS)分析，然后通过数据库检索和鉴定。

由于蚜虫个体微小，体长一般仅为0.5-0.6 mm，体重为10-300 ug(赵惠燕，1988)，并且若蚜寿命一般较短，有些种类的若蚜仅在特定阶段产生等，给唾液的收集和分析带来了很大困难。虽然双层膜收集唾液的方法在上世纪60年代中期就已经基本成熟，但在过去的近50年中，仅在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum、麦二叉蚜Schizaphis graminum、桃蚜等少数种类上获得了成功(Madhusudhan and Miles，1998;Cherqui and Tjallingii，2000;陈巨莲等，2000;郭光喜等，2006;Carolan et al.，2009;Rao et al.，2013)，其中的技术难点一是唾液的收集，二是唾液提取液的浓缩方法。

本研究以五倍子蚜的主要种类角倍蚜Schlechtendalia chinensis 为材料，根据角倍蚜干雌个体微小和体表有蜡粉等特点对唾液的提取和浓缩方法进行了改进和优化，改进的方法能够提取到足够数量的唾液并鉴定蛋白成分。

1 材料与方法

1.1 蚜虫

供试角倍蚜来源于云南盐津，为角倍蚜自然分布区。8月在林间采集新鲜角倍蚜虫瘿，带回室内剖开，取出虫瘿内的干雌，去除蜡粉，置于培养皿内饥饿24 h 后，用于唾液提取。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器

两端开口的圆玻璃管(Φ 3 cm，h 3.5 cm)，Parafilm 膜(PM-996)，Airtech 超净工作台，Sanyo Labo Autoclave 全自动高压蒸汽灭菌器，Forma-80℃ 冰箱，Sigma 3K30 冷冻离心机，Thermo FRESco21 微量冷冻离心机，Christ ALPHA 1-2 LD plus 冷冻干燥仪，Eppendorf 真空离心浓缩仪，Bio-Rad SmartSpec Plus 核酸蛋白测定仪，Electrophoresis power supply-EPS 301 垂直电泳体系，UMAX Powerlook 2100XL 扫描仪，DHP 9052 型电热恒温培养箱，ELGA Purelab Ultra 超纯水系统，Thermo Q-Exactive 液相色谱质谱联用仪，分离柱C18(150 mm×0.18 mm，3 μm)。

1.2.2 试剂

通用蛋白质沉淀剂(上海生工)，尿素、CHAPS、Pharmalyte pH 3-10、二硫苏糖醇(DTT)(GE Healthcare)，蛋白酶抑制剂(罗氏)，牛血清蛋白(BSA)、蛋白定量染料、碘乙酰胺(IAA)(Bio-Rad)，SDS-PAGE 凝胶电泳试剂(USB)，蛋白质Marker、甲酸(FA)(Thermo Fisher)，胰蛋白酶(trypsin)(Promega)，乙腈(ACN)(Sigma)，三氟乙酸(TFA)(Acros)，其余试剂为国产分析纯。

1.3 唾液收集

1.3.1 营养液准备

无菌水:取超纯水(＞18.2 MΩ)，高压灭菌后置于4℃冰箱中保存，保存期7 d 以下。

1.3.2 双层膜夹营养液

将Parafilm 膜剪成小方块，用75%酒精浸泡过夜后在超净工作台内取出、晾干，并在紫外灯下照射灭菌1 h。用双手拉住膜的两侧，慢慢向两边拉伸，直至膜逐渐变薄透明时，小心将膜覆盖在玻璃管管口上，压实。用注射器吸取适量营养液，用针头式过滤器(Φ 0.2 um)过滤后注射到膜的中央位置。然后在营养液上覆上第2 层膜，覆盖时稍拉伸，使两层膜紧密接触，适当挤压营养液使其在两层膜间铺满，并避免产生气泡，在第2 层膜上再覆盖一层保护膜。

1.3.3 蚜虫取食

将盖有营养液的玻璃管悬空放置，营养液一端朝下。从另一端放入角倍蚜干雌，至基本铺满取食膜的表面，数量约为1000-1200 头/管，盖上透气的纱布。置于人工气候室内，调节温度为20℃，相对湿度90%，在玻璃管营养液一端放置黄色光源，吸引蚜虫集中到膜的表面取食，持续24 h。

1.3.4 唾液收集

将玻璃管反转，倒出蚜虫，从外侧小心去掉营养液袋的外层保护膜。用注射器针头在第2 层膜上扎一个小孔，缓慢地吸出含有唾液的营养液。每管约收集100 μL，转移到1.5 mL 离心管内，-80℃保存。重复上述过程，多次收集并将唾液收集液合并，共收集3 批次，每批次为240 管约24 mL，用于后续分析。

1.4 唾液收集液的浓缩和蛋白检测

1.4.1 浓缩

1.4.1.1 超滤膜浓缩

将合并后的唾液收集液转移到截留分子量(MWCO)5000 的超滤管内，7500×g，4℃，离心30 min。转移浓缩液至MWCO 3000 的超滤管内，10000×g，4℃，离心50 min。转移浓缩液至1.5 mL 离心管内，加100 μL 裂解液和5 μL 蛋白酶抑制剂，涡旋混匀。真空离心浓缩，30℃，热干40 min。浓缩液终体积约为100 μL。

1.4.1.2 真空冷冻干燥法

将合并后的唾液收集液置于50 mL 离心管中，-80℃速冻成固态。转移到冷冻干燥仪内，真空冷冻干燥。设置参数为:0.024 mbar，-54℃，至完全干燥为粉末状。加100 μL 去离子水溶解。

1.4.1.3 沉淀法

取10 mL 离心管24 支，每管分别加入1 mL 唾液收集液，根据沉淀剂作用说明，按1∶3 的体积比先加入3 mL 沉淀剂一，涡旋振荡30 s，冰上孵育10 min;再加入3 mL 沉淀剂二，涡旋振荡30 s，冰上孵育10 min。4℃，22000×g，离心5 min。吸出上清液，加入100 μL 去离子水溶解。

1.4.2 蛋白检测

1.4.2.1 Bradford 法定量检测

采用Bio-Rad 蛋白测定仪，选择Protein 程序下Bradford 法。以 15.0 mg/mL 牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白，用蛋白定量染料分别稀释10、13.3、20、40 和100 倍，在595 nm 处测定各管的OD 值。形成以蛋白浓度为横坐标，以OD 值为纵坐标的标准曲线，R2=0.9927。取20 μL

1.4.1 样品浓缩液用蛋白定量染料按2、5、10 倍的浓度梯度稀释，测定595 nm OD 值，对照标准曲线，得到样品的蛋白浓度。

1.4.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

采用垂直电泳仪进行1-DE。每泳道上样量20 μL，包括10 μL 蛋白浓缩液、8 μL 蛋白上样缓冲液2×和2 μL β-巯基乙醇，混匀，沸水浴3 min，冷却至室温。配制分离胶浓度为13%，浓缩胶浓度为4%。以等体积去离子水为阴性对照，10 μL Marker 作为阳性对照。恒流电泳，浓缩胶内电流为15 mA，运行时间为30 min;分离胶内电流30 mA，运行时间约为1 h。当溴酚蓝前沿到达分离胶底部时，停止电泳。分别进行银染和考马斯亮蓝染色、脱色。胶板扫描图采用MagicScan 5.1成像和分析。

1.4.3 质谱分析

1.4.3.1 质谱前样品处理

1.4.3.1.1 溶液酶解(in-solution digestion)

在50 μL 唾液浓缩液中加100 mM 的碳酸氢铵，调节pH 值在8-9 范围内。加1 M 的二硫苏糖醇至终浓度为10 mM，56℃水浴1 h。继续加1 M的碘乙酰胺至终浓度为50 mM，室温下暗反应1 h。按1∶50(V/V)加0.5 ug/uL 胰蛋白酶(trypsin)，37℃恒温培养16 h，用于质谱检测。

1.4.3.1.2 胶内酶解(in-gel digestion)

以银染胶板上的目的条带位置为参照，在考染胶的相同位置用干净刀片切割胶条并切碎，转移胶粒到离心管内，加入适量乙腈(以浸过胶粒为限)，脱水干燥。吸出乙腈，加30-50 μL 10 mM二硫苏糖醇，56℃水浴1 h。加与二硫苏糖醇等体积的50 mM 碘乙酰胺，室温下暗反应1 h。吸出液体，加适量乙腈(以浸过胶粒为限)，5-10 min 脱水干燥。加4-7 μL 15 ng/μL 的胰蛋白酶，4℃放置30 min。再加30-50 μL 25 mM 碳酸氢铵，37℃恒温培养16 h。加30-50 μL 50%乙腈和5%三氟乙酸的混合液，37℃恒温提取1 h。吸出液体，重复提取一次。吸出液体，真空离心干燥。加10 μL 液相A 液:98% 水、2% 乙腈，0.1%甲酸重溶，12000×g 离心，取上清液用于质谱检测。

1.4.3.2 液相色谱质谱联用检测(LC-MS/MS)

取1.4.3.1 酶解产物，采用液相色谱质谱联用仪分析。分离柱为C18，流动相为浓度梯度为5-95%乙腈，流速:200 nL/min，时间:45 min。

1.5 蛋白鉴定

采用Mascot 检索方法，对1.4.3 LC-MS/MS的分析结果进行蛋白检索比对。搜索数据库包括UniProt 数据库(http://www.uniprot.org)和豌豆蚜蛋白数据库ACYPI proteins V2.1b(http://www.aphidbase.com/aphidbase/downloads)。用 于肽段/蛋白质数据库搜索的基因组序列和数据库来自 Human Genome Sequencing Centre at Baylor College of Medicine(www.hgsc.bcm.tmc.edu)和International Aphid Genomics Consortium(www.aphidbase.com)。搜索参数设置:Peptide Mass Tolerance:±0.1 Da，Fragment Mass Tolerance:±0.2 Da，Max Missed Cleavages:2。

2 结果与分析

2.1 蛋白检测结果

2.1.1 Bradford 法定量检测

经Bradford 法定量检测，超滤膜法浓缩液样品的蛋白浓度为0.15 ug/uL;沉淀剂法和真空冷冻干燥法浓缩液样品，没有检测出蛋白(表1)。表明超滤膜法浓缩液中含有蛋白，且浓度已达到质谱分析要求，而沉淀剂法和真空冷冻干燥法不适合于角倍蚜唾液提取液的浓缩。

2.1.2 聚丙酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE)

经垂直板电泳(1-DE)检测，超滤膜法浓缩液样品的银染胶，在蛋白分子量为45-116 kDa范围内出现5 条较浅的条带，考马斯亮蓝染色时没有发现条带;沉淀剂法和真空冷冻干燥法浓缩液样品，银染和考马斯亮蓝染色均没有检测出条带。表明超滤膜法浓缩的唾液提取液中含有蛋白，但浓度较低，仅达到银染检测的浓度范围，而其他两种浓缩方法不适合于角倍蚜唾液提取液的浓缩。

2.1.3 液相色谱质谱联用分析(LC-MS/MS)

经LC-MS/MS 分析，超滤膜法浓缩液的质谱图上有蛋白质峰(图1)，而真空冷冻干燥法浓缩液没有检测出蛋白质峰，沉淀剂法浓缩液中虽然检测出质谱峰，但经鉴定不是蛋白质峰(表1)，而是聚山梨酯-80(Tween-80)，系沉淀剂的成分之一，沉淀剂成分的残留可能影响了唾液蛋白的检测;真空干燥法可能是冻融过程中发生了蛋白质降解，因此浓缩后未能检测出蛋白成分。表明3种浓缩方法中，只有超滤膜法适用于角倍蚜唾液提取液的浓缩。

表1 角倍蚜干雌唾液收集液不同浓缩方法的蛋白检测结果Table 1 Saliva protein detection of Schlechtendalia chinensis by different concentration methods

图1 角倍蚜干雌唾液蛋白的LC-MS/MS 图Fig.1 MS spectrogram of Schlechtendalia chinensis saliva proteins

2.2 蛋白鉴定

对考染胶板44-66.2 kDa 的一条浓度较深的条带的液质联用分析，与豌豆蚜数据库比对检索到31种蛋白，与角倍蚜干雌唾液腺蛋白鉴定结果比对，其中有11个蛋白为共有蛋白;在UniProt 数据库检索到15种蛋白。经过文献比对，检索到的蛋白中有5种与唾液功能有关。表明角倍蚜干雌的唾液提取液中获得了有效的唾液蛋白成分。

3 结论与讨论

蚜虫唾液收集和分析是一个技术性高的精细工作，需要按程序逐步操作，每一步失误都有可能导致收集或分析失败，对于体型较小的蚜虫种类更是如此，其中唾液收集、浓缩及防止唾液蛋白降解是唾液研究的关键。

(1)唾液收集。只有收集到足够量的唾液，才有可能进行唾液蛋白的检测和鉴定。在唾液收集中的关键技术包括:①Parafilm 膜的拉伸。只有将膜拉得足够薄，蚜虫的口针才能穿过膜取食，从而收集到唾液。但如果膜拉伸得过薄，则容易破裂。因此要通过多次练习，掌握合适的拉伸度。②取食管的选择。有的研究采用直径3 cm 的小玻璃管或PVC 管，每管收集唾液40-120 μL(Cherqui and Tjallingii，2000;Habibi et al.，2001;Harmel et al.，2008);另外一些研究采用直径8 cm的大管，每管约收集唾液5 mL(Rao et al.，2013;Carolan et al.，2009)。通过对两种大小玻璃管的比较发现，直径3 cm 的小管更容易掌控膜的拉伸度，收集唾液时不易引起膜的破裂。③营养液的选择。营养液不仅会影响蚜虫的取食行为，还会影响唾液的成分(Miles and Harrewijin，1991;殷海娣等，2006)。蒸馏水和蔗糖溶液是蚜虫唾液收集中采用最多的营养液(Miles and Harrewijin，1991;Tjallingii and Cherqui，1999;Wang YC et al.，2008;Harmel et al.，2008)。在预实验中，我们发现采用15%蔗糖溶液和无菌水作为营养液时，收集的角倍蚜干雌唾液浓度没有显著差异，因此本研究中采用无菌水作为营养液。对于其他浓度的蔗糖溶液对角倍蚜干雌的唾液收集效果，还需要进一步试验。

(2)唾液收集液的浓缩。角倍蚜个体微小，需要将大量的唾液收集液合并后才能达到质谱分析的浓度要求。合并后的唾液收集液体积增大，但唾液蛋白浓度低，需要经过浓缩才能达到质谱分析要求的浓度，因此浓缩方法的选择也很重要。本研究表明，与沉淀剂法和真空冷冻干燥法相比，超滤膜法操作简便，蛋白损失较少，没有引入外来物质，是适合角倍蚜唾液提取液浓缩的有效方法。

(3)防止唾液蛋白的降解。由于唾液中本身含有消化酶，在收集唾液的过程中要从以下两个方面防止唾液蛋白的降解。①取食时间。本研究设置角倍蚜的取食时间为24 h。既保证饥饿后的蚜虫有充分的取食时间，又能避免取食时间过长导致蛋白降解。②加裂解液变性。裂解液能够将唾液蛋白变性，避免其降解。变性后的蛋白并不影响蛋白种类鉴定。因本实验旨在鉴定角倍蚜唾液中的蛋白种类，并不对唾液蛋白进行功能性验证。

在以前的蚜虫唾液研究中，唾液提取成功的种类如豌豆蚜、麦二叉蚜和桃蚜等均为自由生长的蚜虫，人工饲养相对容易，且个体较大。本研究的角倍蚜为个体较小的致瘿蚜虫，通过对现有唾液提取和浓缩方法的改进和优化，成功提取和鉴定出角倍蚜干雌的唾液成分，改进的方法不仅可用于其他体型较小蚜虫的唾液提取，也可为瘿蚜的唾液提取和分析提供借鉴。

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