于建超，王江平，李应龙，钱彪，倪钊，王新敏，李强，王文晓，王勤章

(1石河子大学医学院，新疆石河子832000;2石河子大学医学院附属第一医院)

糖尿病膀胱异常病症(DCP)为糖尿病末期常见的并发症之一，发生率为19%～84%;其临床表现为遗尿、尿不净等，末期会出现尿路感染、肾炎等，最终发展成尿毒症，发生机制目前尚不明确［1］。近年研究发现，膀胱逼尿肌会出现自发性收缩，此收缩完全受到Cajal样细胞的调节［2］。DCP患者受高血糖的诱导，其Cajal样细胞不断萎缩或消失，致使Cajal样细胞出现非特异性变异，导致干细胞因子(SCF)/c-kit信号表达功能减弱，膀胱感觉降低、收缩性减弱，膀胱剩余尿量增加等，最终导致DCP发生［3～8］。研究发现，干细胞白血病基因(SCL)属于c-kit上端必不可少的调控基因，能够有序开启c-kit基因表达，促进Cajal样细胞表型及功能恢复［9～13］。重组慢病毒载体可发挥自主整合作用，以此在主细胞基因链中实现寄宿，在促进主细胞分裂增殖的同时表达目的基因。本研究通过基因工程技术，构建含人SCL基因的重组慢病毒表达载体(GV287-SCL)，旨在为DCP的基因治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 含有SCL基因质粒的绿色荧光蛋白(GFP)购自意大利瑞德基因研究所，感受态大肠杆菌DH5α、293T细胞、GV287-EGFP载体购自南京祥瑞基因公司，DMEM、FBS、转染试剂盒 Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA片段提纯试剂盒与DNA提取试剂盒购自日本QLAGEN生物研究中心，RTPCR试剂盒购自上海吉凯基因化学技术有限公司，SDS-PAGE蛋白电泳仪及蛋白转膜仪购自南京天能生物研究公司。

1.2 人SCL基因扩增 对人SCL基因质粒进行PCR 扩增，上游引物:5＇-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGACCGAGCGGCCGCCGAG-3＇，下 游引物:5＇-TCACCATGGTGGCGACCGGCCGAGGGCCGGCTCCATC-3＇，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。反应条件:94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30个循环;72℃延伸10 min。取10 μL PCR反应产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3 穿梭质粒GV287-EGFP/SCL的设计 提纯包括人SCL基因的PCR扩增因子，通过In-Fusion转换酶的催化将靶基因的PCR产物与GV287-EGFP线性化载体进行结合。

1.4 重组质粒GV287-EGFP/SCL的筛选与鉴定提取含有人SCL基因的GV287-EGFP质粒阳性克隆菌落PCR模板上的交换转化产物，长出菌落后加入10 μL培养基混匀。取1 μL设置模板，PCR法扩增基因。上游引物:5＇-GGTATAAGAGGCGCGACCAG-3＇;下游引物:5＇-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3＇。反应条件:94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环;72℃延伸6 min。取10 μL PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。与阳性转化子对接，分装，进行排序测定。抽选8个转化子，通过SCL引物对其进行PCR检测，采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.5 重组慢病毒GV287-SCL的包装、培养及鉴定培养293T细胞株作为包装细胞，取1.5 mL灭菌EP 管，加入 1.5 μg 包装质粒和 0.5 μg 表达质粒以及250 μL无血清培养基，混匀后室温下孵育5 min;将9 μL 脂质体、250 μL 无血清培养基置于1.5 mL EP试管中，轻轻震荡混合，室温下孵育5 min。将上述含DNA的溶液与脂质体液均匀摇摆混合，室温下孵育20 min。采用胰蛋白酶消化293T细胞并计数，置于有血清的培养液中。将上述 DNA、脂质体混合物置于6孔培养板，给予1 mL含血清培养基培养。将1 mL 293T细胞悬挂，并置于6孔培养板，37℃CO2孵箱里孵化48～72 h，3 000 r/min离心20 min，过滤沉淀物，通过PVDF过滤膜筛选慢病毒原液。对含有病毒的血清进行梯度稀释分组(1∶100)，将其分为标准液与待测液，将两种液体同时感染293T细胞，采用荧光标记法计算病毒滴度［8］;提取293T细胞蛋白，采用Western blotting法检测目的基因。

2 结果

2.1 人SCL基因扩增产物鉴定 PCR产物大小为1 036 bp，与目的基因相关片段中SCL cDNA大小相同，见图1。

图1 人SCL基因的扩增PCR产物电泳图

2.2 重组质粒GV287-EGFP/SCL阳性克隆鉴定阳性转化子通过扩展后，均形成503 bp条带，其大小与目的片段人SCL cDNA相当;阴性转化子得到192 bp条带;见图2。重组质粒 GV287-EGFP/SCL阳性克隆测序结果显示，目的基因SCL成功插入到GV287-EGFP，基因排序与GenBank信息库里的人SCL基因mRNA基本相同。

2.3 重组慢病毒GV287-SCL鉴定及病毒滴度确定 重组慢病毒GV287-SCL作用293T细胞1天即观察到细胞核内出现GFP表达。提取蛋白，采用Western blotting法检测到72 kD附近出现特征条带，其大小与SCL-GFP融合蛋白基本吻合。重组慢病毒在多次感染、外扩和提纯之后，滴度为5×108TU/mL。

图2 重组质粒GV287-EGFP/SCL阳性克隆电泳图

3 讨论

Cajal样间质细胞控制膀胱逼尿肌的自发性兴奋与收缩，属于实际上的起搏介质。Cajal样间质细胞的表达与其特异性酪氨酸激酶受体c-kit密切相关，通过对SCF/c-kit信号传输路径激活，维持Cajal细胞的外型和生理特性。SCL基因异常表达会导致急性T淋巴细胞白血病，且SCL与造血和血管内皮发育有关。SCL属于多因素复合体的转化因子，能够增强ckit诱导因子的活性，但不会影响单核细胞开启活性的变化［14］。鉴于SCL在Cajal样间质细胞发育中的关键作用，如果通过基因技术组建人SCL基因重组慢病毒载体，将SCL基因转染Cajal样间质细胞，增加 SCL的表达，逆转Cajal样间质细胞表型和功能的恢复［15］，可为进一步探究DCP的基因治疗提供理论依据。

慢病毒作为基因治疗的一个常规介质，可以有效且针对性地对分裂或非分裂细胞实现感染，将外源基因有效导入寄主细胞的细胞核上，具有周期长、特性稳固、表达显著等特点，能够用来开展体内外实验。本研究采用的慢病毒包装系统是三质粒包装，其中包含1个表达载体，含有目的基因、报告基因GFP、目的基因的启动子以及其他病毒包装所需的必要元件;另外包含2个辅助质粒的包装质粒，表达产生包装病毒所需的结构蛋白。表达载体和包装质粒形成反式互补，且包装质粒又分别由2个质粒构成，安全性得到保障。GFP是一种在蓝色光激发下会发出稳定绿色荧光的生物荧光蛋白，无细胞毒性，现已作为标记分子或报告基因被广泛应用于细胞学和活体组织的检测。本实验选用GFP作为慢病毒的标记基因，GFP荧光具有稳定且清晰可见的优点，在荧光显微镜下可以对活细胞进行定时、定位的观察，实验中可随时观察三质粒转染293T细胞生成病毒的情况，准确、直观观察结果。在实验过程中，我们收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其进行反复浓缩、纯化，得到高滴度慢病毒原液，转染293T细胞后测定目的基因表达，并采用荧光法标定病毒滴度。结果表明慢病毒滴度为5×108TU/mL，可满足大多数转染相关实验需求［14，15］。

本研究运用基因工程技术和分子生物学技术，成功制备了人体SCL基因重组慢病毒载体GV287-SCL，慢病毒滴度为5×108TU/mL;上述结果为继续进行该基因体内转染及开展DCP的基因治疗奠定了基础。

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