张双霞，张国梁，鲍文漪

(天津市第一中心医院，天津300192)

胆管癌早期诊断困难，预后差，近年来其发病率呈不断上升趋势。其中肝外胆管癌约占胆管癌的80%～90%，影像学上主要表现为胆管狭窄，与胆管良性狭窄的鉴别困难［1］。胆管癌恶性程度高，手术切除是惟一有效的治疗方法;胆管良性狭窄多可通过内科方法治疗，如内镜下支架植入等。因此，两者准确鉴别对患者治疗方案的制定及预后判断均有重要意义。目前，胆管癌的诊断主要依赖于影像学、细胞学及生物化学方法的联合应用，但敏感性和特异性均不高。K-ras基因和p53基因突变在消化道肿瘤中的研究较多，但其在胆汁标本中的研究少见。本研究检测肝外胆管癌患者胆汁上清液及沉淀物中K-ras、p53基因突变情况，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年8月～2013年8月天津市第一中心医院诊治的肝外胆管癌患者57例(胆管癌组)。其中，男32例、女25例，年龄39～81(59.9±7.9)岁。均经手术病理、胆管刷片或胆汁细胞学检查确诊。UICC分期［2］为Ⅰ～Ⅱ期21例、Ⅲ～Ⅳ期36例，肿瘤位于胆管上段25例(肝门部)、中段19例、下段13例。排除肝内型(周围型)胆管癌。选取同期胆管良性狭窄患者42例(良性狭窄组)，男27例、女17例，年龄27～77(56.7±6.3)岁，其中胆管结石合并胆管炎性狭窄21例、胆囊切除术后胆管狭窄7例、慢性胰腺炎胰头纤维化肿大压迫胰腺段胆总管5例、硬化性胆管炎3例、胆管良性肿瘤3例、胆总管囊肿2例、Mirrizi综合征胆管狭窄1例。两组性别、年龄具有可比性。

1.2 胆汁中K-ras、p53基因突变检测 两组术前均进行经内镜逆行性胰胆管造影(ERCP):患者均取左侧卧位或俯卧位，将电子十二指肠镜(Olympus JF-40)插至十二指肠降部，拉直镜身，摆正乳头位置，选择性胆管插管;插管成功后，于狭窄近端抽取胆汁约10 mL，4 h内3 000 r/min离心10 min，分别取胆汁上清液和沉淀物200 μL，置于1.5 mL离心管中，加入 20 μL QIAGEN 蛋白酶及 200 μL缓冲液，置于55℃水浴中消化12 h，取出振荡，100℃保温8 min后振荡，13 000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR模板。根据Gene Bank提供的序列分别选择 p53 易突变外显子 5、6、7、8，K-ras基因外显子1设计相应的引物，引物序列及扩增片段长度见表1。PCR反应总体积均为25 μL;反应条件均为94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、52 ℃ 1 min、74 ℃ 1 min，40个循环;74℃延伸10 min。取PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统分析并拍照，以确定PCR产物。另取PCR产物，采用95%甲酰胺于85℃加热变性15 min，冰浴，上样于12%的聚丙烯酰胺凝胶，在4℃恒压150 V条件下电泳约8 h，结束后进行SSCP银染色，双蒸水漂洗，显影液显色，加入固定液终止反应，分析PCR产物基因突变情况。SSCP银染色异常电泳带(突变)表现为条带异常涌动、条带增加或缺失。p53的4个外显子均为正常者判定为野生型，4个外显子中有1个存在突变者判定为突变型。

表1 引物序列

1.3 K-ras、p53突变基因的DNA纯化和测序 对PCR产物进行DNA纯化和测序，由上海英骏生物技术有限公司完成，以进一步明确经PCR扩增的K-ras和p53基因片段碱基序列突变情况及其突变序列。

1.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。计量资料以±s表示，比较采用t检验;计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 K-ras、p53基因突变情况 ① K-ras基因突变情况:良性狭窄组胆汁标本中未发现K-ras基因突变。胆管癌组胆汁标本中K-ras基因突变率为77.19%(44/57);其中上清液为 66.67%(38/57)，沉淀物为59.65%(34/57)，两者比较 P ＞0.05;44例K-ras基因突变阳性标本中，10例只在上清液中发现K-ras基因突变，6例只在沉淀物中发现K-ras基因突变，28例上清液和沉淀物中均发现K-ras基因突变。②p53基因突变情况:良性狭窄组胆汁上清液及沉淀物标本均未检出p53基因突变。胆管癌组40例患者胆汁SSCP染色提示有p53基因突变，其中第5外显子突变4例、第6外显子突变7例、第7外显子突变6例、第8外显子突变23例，阳性率为 70.18%(40/57);其中上清液为 63.16%(36/57)，沉淀物为 45.61%(26/57)，两者比较 P＜0.05。40例p53基因突变阳性标本中，14例只在上清液中发现基因突变，4例只在沉淀物中发现基因突变，22例上清液和沉淀物中均发现基因突变。见表2。③联合检测胆管癌患者胆汁上清液和沉淀物中p53基因和K-ras基因突变率(一种基因突变即记为突变)为85.97%(49/57)。

表2 两组胆汁上清液和沉淀物中K-ras、p53基因突变情况［例(%)］

2.2 胆管癌组K-ras、p53突变基因的DNA测序经DNA测序分析显示，突变型K-ras基因突变第1外显子和p53第5、6、7、8外显子碱基序列的改变均与PCR-SSCP阳性条带数一致;同一病例胆汁上清液和沉淀物中PCR-SSCP阳性条带、碱基序列的改变均一致。胆管癌组K-ras基因突变发生于第12密码子42例，发生于第6和第36密码子2例;其突变方式以GGT→GAT和GGT→GCT最多，亦有GGT→GTT、AGT→TGT;绝大多数为点突变，2例为插入突变。40例患者p53基因突变，均证实有DNA碱基改变，基因突变形式有多种，有多个突变位点，但大多数突变类型为 G→A和 T→C，如 codon 202(CGT→CAT)、codon 248(CGG→CAG、TGG→CGG)、codon 175(CGC→CAC)、codon 245(GGC→AGC、GGC→GCC)、codon 249(AGG→AAG)、codon 273(TTG→CTG)等。

3 讨论

胆管癌发病隐匿，恶性程度高，一旦发现多为晚期，手术切除率低，预后差［3，4］。肝外胆管癌在影像学上主要表现为胆管狭窄，其诊断主要依赖于临床表现与影像学检查。尽管大部分胆管狭窄属于恶性病变，但胆管炎症、损伤、畸形、结石、结核、硬化性胆管炎等良性狭窄占胆管狭窄的30%，与胆管癌有相同的临床和影像学表现，单凭临床和影像学检查不能做出明确的定性诊断。据报道，即使在手术前经多项检查考虑为恶性狭窄的患者，术后仍有15%～24%的患者被证实为良性狭窄［5，6］。尽管 ERCP胆管刷检、胆汁细胞学检查、超声内镜引导下细针穿刺活检术(EUS-FNA)等方法对鉴别诊断有很大帮助，但由于胆管肿瘤常被增生的结缔组织包埋，组织获取困难，脱落肿瘤细胞易在胆汁中变性溶解，检查阳性率仍较低。文献报道，胆管刷取物和胆汁细胞学检查诊断胆管癌的阳性率仅为40%和30%［7］。此外，ERCP胆管刷检诊断胆管癌的敏感性较低，仅30%～50%;EUS-FNA诊断胆管癌的敏感性达85%，但为有创检查，不能广泛开展。血清肿瘤标志物如糖类抗原199、癌胚抗原等对胆管癌的诊断有一定辅助价值，但敏感性和特异性均不高［8］。胆管癌细胞生活在胆汁环境中，加上胆汁酸盐对癌细胞膜的破坏作用，故胆汁中存在丰富的肿瘤DNA［9］，可作为诊断胆管癌的标本。

研究证实，癌基因K-ras和抑癌基因p53突变与消化道肿瘤的发生密切相关。国外文献报道，胆管癌p53和K-ras基因突变率为36%～70%，提示p53与K-ras基因检测对胆管癌的分子诊断有重要意义［10］。但 Itoi等［11］报道，胆管癌患者胆汁标本中p53基因突变率仅33.3%，K-ras突变率可达50%;Yamaguchi等［12］报道，检测胆汁中 p53 和 K-ras基因突变对胰腺及肝胆管恶性肿瘤的诊断敏感性约为25%，低于脱落细胞学检查。Ha等［13］报道，胰腺癌胰液上清液K-ras基因突变阳性率高于胰液沉淀物，提示体液上清液的诊断价值高于沉淀物。Wang等［14］分析30例胆管癌患者胆汁上清液和沉淀物中K-ras基因突变，发现上清液中基因突变率高于沉淀物;联合检测上清液和沉淀物中K-ras基因突变率，可以显著提高胆管癌的基因诊断率。本研究不仅从胆汁的沉淀物，而且从胆汁的上清液中提取DNA，进行K-ras、p53基因突变检测。结果发现，胆管癌患者胆汁标本中存在K-ras、p53基因突变，其中p53基因突变率为70.18%，K-ras基因突变率为77.19%;联合检测胆汁上清液和沉淀物标本中K-ras和p53基因总的突变率可高达为85.97%，诊断敏感性提高;并经DNA测序证实。

Kubicka等［15］检测56例硬化性胆管炎患者胆汁中K-ras基因突变，并进行34个月的随访，发现17例胆汁K-ras基因突变阳性患者中有4例发生癌变，而39例K-ras基因突变阴性者均无癌变发生。提示胆汁及胆管刷取物中K-ras基因突变检测且对胆管癌的早期诊断有一定实用价值。本研究中良性狭窄组均未发现胆汁中K-ras、p53基因突变，对患者进行2年随访也均未发现恶性病变;提示胆汁K-ras、p53基因突变检测对诊断肝外胆管癌特异性较高。

综上所述，肝外胆管癌患者胆汁上清液及沉淀物中可检测到K-ras、p53基因突变，且联合检测阳性率更高;检测胆汁中K-ras、p53基因突变情况可用于肝外胆管癌与胆管良性狭窄的鉴别诊断。

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