蓝金红 陶立 李军 闭炳芬 黄明学 蓝显利 胡萍 马春霞农启文 陈泽祥 杨威 韦志锋 兰美益 秦若甫

（1，广西壮族自治区马山县动物疫病预防控制中心 530600;2，广西兽医研究所 530001;3，广西畜禽疫苗新技术重点实验室 530001）

马山黑山羊主要疫病病原调查

蓝金红1陶立2,3李军2,3闭炳芬2,3黄明学1蓝显利1胡萍1马春霞2,3农启文1陈泽祥2,3杨威2,3韦志锋2,3兰美益2,3秦若甫2,3

（1，广西壮族自治区马山县动物疫病预防控制中心 530600;2，广西兽医研究所 530001;3，广西畜禽疫苗新技术重点实验室 530001）

为了掌握马山黑山羊主要疫病病原种类，本研究采用现场调查、病原分离培养、血清学检测、生化特性鉴定、生长抑制试验、PCR鉴定、动物致病性试验和蠕虫学剖解等方法对2013～2014年81例马山黑山羊病例进行病原学调查。调查结果显示，细菌感染的病例59例，病毒感染的病例8例，寄生虫病12例，中毒病2例，主要病原为绵羊肺炎支原体、大肠杆菌、染性脓疱病毒。药物敏感性试验结果显示，分离到的细菌只对环丙沙星、头孢噻肟、头孢曲松钠、左氧氟沙星敏感;而支原体则对壮观霉素、环丙沙星、卡那霉素、阿米卡星、林可霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考高度敏感。本研究结果对马山黑山羊疫病防控具有一定的指导意义。

黑山羊;疫病;绵羊肺炎支原体;调查

马山县位于广西中南部，地处红水河南岸，大明山北麓，山多林密，当地饲养的黑山羊因全身黑毛，生长发育快，板肉厚满，皮毛质软细小，瘦肉率高，肉质鲜嫩，味美膻气少，香甜可口，营养价值高等独特之处，在中国东南沿海一带及港澳台地区享有较高声誉，是专供香港的优质山羊品种。2000年以来，在政府的大力推动下，马山黑山羊养殖得到迅速发展，但是，随着饲养规模的扩大、养殖方式的转变以及养殖户缺乏疫病防控知识，黑山羊疫病的发生逐年增多，给养殖户造成严重的经济损失，严重制约了黑山羊产业的健康发展[1,2]。为此，我们于2013～2014年对马山黑山羊开展疫病调查，摸清疫病种类，以期为其防控提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料

检测样本采集自81个病例的羊肺、肝、肾、淋巴结、痘疹结节、痂皮、胸腔积液、脓汁、小肠内容物、直肠粪便或粪便拭子等。

1.1.2 试验动物

未免疫过羊支原体疫苗的15kg左右黑山羊购自马山县个体养殖户；20g左右昆明种小白鼠购自广西医科大学实验动物中心。

1.1.3 试剂和仪器

PPLO肉汤购自杭州百思生物技术有限公司。马血清购自广东蕊特生物科技有限公司。TSA琼脂和TSB培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；麦康凯琼脂、营养琼脂和TSI琼脂购自广东环凯生物科技有限公司；马丁汤、兔血琼脂培养基为广西兽医研究所细菌室制。衣原体微量血清诊断试剂盒、绵羊肺炎支原体Y98型冻干阳性血清和丝状支原体山羊亚种PG3型冻干阳性血清购自兰州兽医研究所。大肠杆菌血清定型试剂盒购自中国兽医药品监察所。细菌微量生化鉴定管和药敏试纸片购自杭州天和生物技术有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒、病毒基因组提取试剂盒、PCRTaqMix等分子生物学试剂购自康为世纪生物科技有限公司。PCR仪购自日本TaKaRa公司，凝胶成像系统购自美国AlphaInotech公司。

1.2 方法

1.2.1 支原体的分离和鉴定

无菌取病羊肺组织1小块，加5ml培养液匀浆，4000r/min离心15min，取适量肺组织上清液或胸腔积液接种到含20%马血清PPLO肉汤培养基中，置37℃含5%CO2培养箱中培养5～7d，并盲传2～3代，发现24h后才开始变黄且液体透亮的培养物，经0.45μm细菌滤器过滤后，按10%（v/v）的接种量将滤液加入到含20%马血清PPLO肉汤培养基中继续传1～2代，若传代培养基仍然变黄，可在PPLO固体培养基上划线，37℃培养，倒置于显微镜上，在40×光学显微镜下观察菌落的生长和形态。挑取单个菌落涂于载玻片上，火焰固定，分别作革兰氏和姬姆萨-瑞氏染色，光学显微镜下观察其染色形态。按陶立等（2012）和储岳峰等（2009）方法进行支原体的生长抑制试验和PCR鉴定[3,4]。

1.2.2 细菌的分离和鉴定

取病变组织分别接种TSA琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、TSI琼脂培养基、马丁汤和兔血琼脂培养基，37℃培养24～48h，挑取单个菌落涂于载玻片上，火焰固定，革兰氏染色，光学显微镜下观察染色形态。按陈泽祥等（2008）方法进行细菌16SrRNA基因的PCR扩增和鉴定[5]。PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序。将纯化的分离菌接种微量生化反应管，37℃培养48h进行细菌的生化特性测定。应用大肠杆菌血清定型试剂盒对分离的致病性大肠杆菌进行O抗原血清分型。

1.2.3 病毒的检测

将采集的病羊痘疹结节或痂皮用加有双抗的生理盐水研磨，反复冻融3次，4000r/min离心10min，取上清液，应用病毒基因组提取试剂盒提取病毒基因组DNA或RNA，按刘棋等（2006）和向智龙等（2010）方法进行山羊痘病毒和羊口疮病毒的PCR检测[6,7]。

1.2.4 衣原体检测

由于马山黑山羊均未免疫衣原体疫苗，因此采用血清学检测方法来判断病羊是否感染衣原体，检测方法和判定标准按说明书进行。

1.2.5 寄生虫和中毒检测

按蠕虫学剖解的方法检查和观察病羊实质脏器中寄生虫的虫体；采用沉淀法和饱和盐水或糖水漂浮法检查粪便中虫体、虫卵或卵囊的形态。按现场调查，症状以及治疗的结果进行是否中毒的诊断。

1.2.6 分离病原菌的致病性试验

将4ml支原体纯培养物（3×108CFU/ml)气管接种于黑山羊，观察和记录黑山羊的临床变化情况，30d后剖解试验羊。将纯化的分离菌接种小白鼠，试验组每只小鼠腹腔接种0.3ml菌悬液，对照组小白鼠腹腔接种等量PBS作对照。

1.2.7 分离病原菌的药物敏感性试验

按李军等（2011）和秦若甫等（2011）方法进行细菌的药物敏感性测定[8,9]。

2 结果与分析

2.1 马山黑山羊主要疫病的病原检测

通过对81个病例的病原检测、分离和鉴定，确诊细菌感染的病例59例，占全部病例的72.8%（59/81）；病毒感染的病例8例，占9%（8/81）；寄生虫病12例，占14.8%（12/81）；中毒病2例，占2.5%（2/81）。检测到的细菌性病原为绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、大肠杆菌、绿脓杆菌、奇异变形杆菌、伪结核棒状杆菌和衣原体；病毒性病原为传染性脓疱病毒；寄生虫有扩展莫尼次绦虫、毛首线虫等多种园线目线虫、艾美耳球虫和肝片吸虫；中毒病为霉菌毒素中毒，见附表。

附表 马山黑山羊病例和病原数

在81个病例中，有37个病例是支原体肺炎及其混合感染，占全部病例的45.7%（37/81），其中以绵羊肺炎支原体占多，达34例。对分离绵羊肺炎支原体的山羊致病性试验表明，攻毒后第2d，山羊出现体温升高至39.8℃，并维持至高度后第17d；攻毒后第4d开始流鼻涕，第13d开始咳嗽，直至试验结束仍未康复；剖检肺脏可见肺淤血，有不同程度出血性 “肝变”，甚至 “胰变”，这表明分离到的绵羊肺炎支原体具有一定的毒力，因此，绵羊肺炎支原体是马山黑山羊的主要疫病病原。

分离到的大肠杆菌、绿脓杆菌、奇异变形杆菌、伪结核棒状杆菌对小白鼠均具有致死性，表明这些细菌在感染过程中均有一定的毒力。利用凝集法对分离到的18株致病性大肠杆菌进行血清分型，鉴定出6个血清型，分别是O78（2株）、 O13（5株）、 O15（4 株）、 O20（3 株）、 O101（1 株）、O26（3株），O78能致羔羊和小白鼠发病死亡；O13、O15、O20、O101、O26能引起羔羊黄白痢。检测到的衣原体病主要是引起流产和结膜炎。

2.2 马山黑山羊病原菌的药物敏感试验

分离到的细菌药物敏感试验显示，只有少数药物，如环丙沙星、头孢噻肟、头孢曲松钠、左氧氟沙星是敏感药物，青霉素G、阿莫西林、林可霉素对细菌已经无效。支原体药物敏感试验显示，壮观霉素、环丙沙星、卡那霉素、阿米卡星、林可霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考是高度敏感药物。

3 讨论

临床病例诊治分类调查统计结果显示，目前危害马山黑山羊的主要疫病是细菌性传染病占72.8%（59/81），病毒性疾病占9.9%（8/81）， 寄生虫病占14.8%（12/81）， 霉菌中毒性疾病占2.5%（2/81）等。在细菌性传染病中支原体肺炎占62.7%（37/59） （含和寄生虫或其他细菌的混合感染）；大肠杆菌病占25.4%（15/59）； 衣原体病占6.8%（4/59）， 此外还有伪结核病、绿脓杆菌病和奇异变形杆菌病等。在病毒性疾病中以传染性脓疱常见，寄生虫病中以绦虫和线虫危害最大。这些疫病是当前马山黑山羊临床上常发性疾病，其中支原体肺炎、传染性脓疱、山羊痘、大肠杆菌病、绦虫和线虫病是防控重点。

药物敏感性试验结果表明，目前马山黑山羊的常见病原菌已经对大多数抗菌药物产生耐药性，因此，在今后治疗时，不能盲目用药，一定要做细菌的分离和药物敏感性试验，选择对细菌高度敏感药物，按疗程和使用剂量进行治疗。

从诊治的病例来看，虽然未碰到链球菌病、梭菌性疾病、沙门氏菌病、布鲁氏病等，但这些疾病在广西其他地区的山羊中有发病或血清学检测阳性的报道[10]，同样要引起我们高度重视。随着流通的增多、养殖规模的越来越大，导致场地和环境的污染必将会越来越严重，条件性致病菌的危害肯定会加大，混合性感染病例会增多，2014年小反刍兽疫在全国各地已经发生，给山羊产业带来更大的威胁。因此，在平时的养殖过程中，一定要强化饲养管理、增强防疫等综合性防治措施，政府部门要加强防疫制度的建立，确保疫苗有效供给等，切实有效防止这些疾病的发生。

[1]闭炳芬,陶立,李军,等.马山黑山羊支原体肺炎病原的鉴定[J].中国畜牧兽医,2014,41（9）：249-253.

[2]陶立,蓝显利,闭炳芬,等.羔羊奇形变异杆菌与支原体混合感染的诊断[J].中国畜禽种业,2014(12)：104-106.

[3]陶立,李军,韦志锋,等.广西圈养山羊传染性胸膜肺炎流行病学调查和综合防治措施[J].黑龙江畜牧兽医,2012(1)：98-99.

[4]储岳峰,高鹏程,赵萍,等.应用双重PCR方法检测羊支原体肺炎病原[J].畜牧与兽医,2009,41（12）：23-27.

[5]陈泽祥,禤雄标,许力干,等.鳖源格氏乳球菌的分离及鉴定[J].现代农业科技,2008(10)：151-154.

[6]刘棋,黄夏,郭建刚,等.山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究[J].中国预防兽医学报,2006,28（5）：394-398.

[7]向智龙,程振涛,卓建华,等.羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用[J].贵州农业科学,2010,38（7）：145-147.

[8]李军,禤雄标,谢宇舟,等.广西畜禽大肠杆菌O157：H7流行病学调查[J].中国人兽共患病学报,2011,27（12）：1151-1155.

[9]秦若甫,李智红,韦志锋,等.二株绵羊肺炎支原体药物敏感性试验和临床治疗体会[J].广西畜牧兽医,2011,27（3）：165-166.

[10]陶立,韦志锋,兰美益,等.广西山羊主要疾病流行病学调查[J].中国畜牧兽医,2010,37（2）：138-140.

广西水产畜牧局科技项目（桂渔牧科072411，桂渔牧科08283-2）;南宁市科技攻关项目（20132312）。

蓝金红（1970-），女，广西人，学士，兽医师，主要从事动物疫病防治工作。

陶立（1964-），男，广西人，学士，高级兽医师，从事动物疫病的防治和研究。

杨威（1957-），男，广西人，研究员，从事动物疫病的防治和研究。

黄明学（1964-），男，广西人，畜牧兽医师，从事动物疫病的防治和研究。