任小林　宋珍　杨斌盛

(山西大学分子科学研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，太原030006)

2，6-吡啶二甲酰肼2-羟基萘甲醛酰腙-Cu(Ⅱ)-CopC三元配合物的光谱研究

任小林宋珍杨斌盛＊

(山西大学分子科学研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，太原030006)

以2，6-吡啶二甲酸为原料，经酰化、酯化、胺解、亲和加成合成2,6-吡啶二甲酰肼-2-羟基萘甲酰腙(L1)。用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、荧光寿命方法研究了酸碱对L1互变异构的影响及L1、Cu(Ⅱ)、铜运输蛋白(copper trafficking protein，apoCopC)三者的相互结合。结果表明，在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲条件下，L1可分别与Cu(Ⅱ)、apoCopC结合形成1∶1的配合物，条件结合常数分别为3.32×106mol-1·L和4.01×105mol-1·L；而Cu(Ⅱ)-L1与apoCopC结合形成1∶1复合物的条件结合常数为8.09× 105mol-1·L。荧光共振能量转移、分子对接模拟表明，L1结合在apoCopC的N端，光谱滴定证实L1、Cu(Ⅱ)、apoCopC可形成以Cu (Ⅱ)为中心的三元配合物。

2，6-吡啶二甲酰肼2-羟基萘甲醛酰腙；Cu(Ⅱ)；铜运输蛋白；配合物；光谱

CopC蛋白是革兰氏阴性菌(Pseudomnas syringae)抗铜操纵子cop所编码的4个蛋白(CopA、CopB、CopC、CopD)之一[1-2]，其溶液结构呈现由“loop”相连β折叠疏水桶状结构，相距大约3 nm的2个金属离子结合位点位于疏水桶的两端，其中位于蛋白C端的Met残基(40，43，46，51)中的2或3个及His48与Cu(Ⅱ)配位，而位于蛋白N端的His1、Asp89、Glu27和His91与Cu(Ⅱ)配位[3-5]。Cu(Ⅱ)-CopC的氧化或Cu(Ⅱ)-CopC的还原能使得铜离子从一个位点迁移到另一个位点[1-2]，即CopC在铜离子调控中起着重要的作用。研究有机小分子对CopC结合铜的影响、探讨CopC铜调控的分子机理具有重要意义[6]。

本工作基于溶液中2，6-吡啶二甲酰肼2-羟基萘甲醛酰腙(L1)分别与Cu(Ⅱ)、apoCopC的结合性质，研究了L1-Cu(Ⅱ)-apoCopC三元配合物的形成。

1　实验部分

1.1试剂和仪器

2，6-吡啶二甲酸，99%，aladdin产品；2-羟基-1-萘甲醛，99%，北京百灵威；二氯亚砜、无水甲醇，分析纯，天津市化学试剂三厂；水合肼，分析纯，天津市天大化工实验厂；乙二胺四乙酸(EDTA)为沈阳试剂四厂产品；三羟甲基氨基甲烷(Tris)为上海化学试剂厂产品，其它试剂均为分析纯。

Varian-Cray Eclipse荧光光谱仪；Edinburgh Analytical Instrument type nF-900荧光寿命仪；Cary 50 Bio UV-Visible吸收光谱仪；德国产VarioELⅢ型元素分析仪；Shimadin-FTIR-8400S红外光谱仪；Bruker DRX-300 MHz核磁共振仪；Eppendorf移液枪。

1.2实验方法

配体L1的合成：使用2，6-吡啶-二甲酸、2-羟基1-萘甲醛、SOCl2、水合肼(80%)为原料，按照文献方法[7]由图示1所示路线合成2，6-吡啶二甲酰肼2-羟基萘甲醛酰腙。

图示1配体的合成路线Scheme 1Synthetic route of L1

取2，6-吡啶-二甲酸3.34 g和SOCl211 mL置于圆底烧瓶中，加热回流2 h，冷却后在冰水浴搅拌条件下缓慢滴加甲醇并继续加热1 h。静置、冷却、洗涤得白色2，6-吡啶二甲酸二甲酯沉淀。将3.90 g 2，6-吡啶-二甲酸二甲酯用无水甲醇30 mL溶于圆底烧瓶中，加入6 mL水合肼(80%)，加热回流片刻，静置、冷却、过滤、洗涤得到白色2，6-吡啶二甲酰肼固体。干燥后测得其熔程为123～124℃。称取0.20 g 2，6-吡啶二甲酰肼加入到100 mL圆底烧瓶中，再加入约20 mL水，加热至体系全部溶解。加入适量2-羟基-1-萘甲醛乙醇溶液，加热回流2 h，冷却，过滤、洗涤并收集生成的黄色2，6-吡啶二甲酰肼2-羟基萘甲醛酰腙固体。熔点>300℃。

元素分析实测(理论)值(%)为：C，69.15(69.18)；H，4.22(4.20)；N，4.22(4.20)。1H NMR(DMSO)：δ为12.50(s，2H，-OH)，12.50(s，2H，-NH)，9.80(s，2H，-CH =N)，8.51～7.65(m，6H，萘环)，7.46～7.24(m，3H，吡啶环)。IR(KBr压片)：ν为3 462(O-H…O)，3 229(NH), 1 682 cm-1(C=O)。

apoCopC的制备按照文献[5]方法，通过吸收光谱测定其在278 nm处的吸光度值计算其浓度。

1.3光谱测定

紫外-可见吸收光谱在Cary 50 Bio UV-Vis吸收光谱仪上测定，室温条件下用1 cm吸收池测量。荧光光谱在Cary Varian Eclipse荧光分光光度计上测量，激发和发射狭缝均为5 nm。实验过程通过循环水浴控制温度，所有测定均恒定在25℃。

荧光寿命的测定在Edinburgh Analytical Instrument type nF-900荧光仪上进行，用时间关联单光子计数法测定。激发光源为EPLED-280，用Ludox HS-30硅溶胶散射液为仪器响应(IR)，根据(1)式由其最大荧光发射波长处的荧光衰减曲线非线性拟合得出样品的荧光寿命值。

2　结果与讨论

2.1配体L1的性质

2.1.1酸度对L1光谱性质的影响

图1是L1在不同pH值条件下的紫外-可见吸收光谱(A)和荧光光谱(B)。可见，当pH<9.0时L1的最大吸收峰位于375 nm附近，随着pH值的增大，L1在375 nm处的最大吸收峰逐渐减小，同时在430 nm附近出现新的吸收峰，即L1的最大吸收峰由375 nm(pH=7.4)红移为约430 nm(pH=11.0)，且在400 nm处出现等吸收点；与酸度对L1紫外-可见吸收光谱的影响不同，其激发波长为400 nm时的荧光光谱(图1B)最大峰位于515 nm处，随着pH值的增加，最大发射峰位没有明显的变化，仅有荧光强度的减弱，直至完全被猝灭(pH>9.0)。

图1不同pH值溶液中L1的紫外-可见吸收光谱(A)和荧光光谱(B)Fig.1　UV-Vis absorption(A)and fluorescence spectra(B)of L1 in solutions with different pH values CL1was 10 μmol·L-1,λex=400 nm,20℃

图2A为L1在不同pH值条件下515 nm处荧光随时间衰减的变化曲线。由图2A可见，随着溶液pH值的增加，515 nm处荧光衰减变慢，即荧光寿命变长。按照(1)式非线性拟合不同pH值时的衰减曲线，均表现为双指数衰减，即短寿命、长寿命发光体荧光衰减的叠加。

表1列出L1在不同pH值时短寿命、长寿命发光体的拟合参数。其中短寿命发光体荧光衰减的贡献随着pH值的增加而减少，而长寿命发光体荧光衰减的贡献随着pH值的增加而增加(见图2A插图)，在pH=9.3时短、长寿命发光体各有约50%。短寿命发光体的τ1平均值为(2.02±1.30)ns，长寿命发光体的τ2平均值为(7.83±0.97)ns。

图2　不同pH值(A)、溶剂(B)时L1荧光(515 nm)衰减曲线Fig.2　Fluorescence decays of L1 in different pH values(A)and solvents(B)

酰腙由于有酸性的α-H，不同的pH值会影响质子转移，形成酮式和烯醇式[8]。碱性增加，会夺去酮式的α-H，然后负电荷离域到酮的双键，形成烯醇式。因此，溶液的酸碱性对酰腙化合物的构型有一定的影响，改变酰腙的两种异构体在溶液中的分布平衡(图示2)。碱性溶液可稳定酰腙的烯醇式构型。由图1A可见，当pH<9.0时，L1主要为酮式构型；当pH>9.0时，L1主要以烯醇式构型存在。由图2A可见，酮式构型L1的荧光寿命为(2.02±1.30)ns，烯醇式构型L1的荧光寿命为(7.83±0.97)ns。

表1　L1在不同pH值和不同溶剂中的荧光寿命参数Table 1Time resolved fluorescence decay parameters of L1 at different pH values and in different solvents

图示22，6-吡啶二甲酰肼2-羟基萘甲醛酰腙的两种异构体形式Scheme 2Isomer forms of L1

2.1.2溶剂对L1光谱性质的影响

随着溶剂极性的增大，L1紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱都有一定的红移和强度增加，如DMF为溶剂时紫外最大吸收峰为370 nm，最大荧光峰为510 nm，而H2O为溶剂时紫外最大吸收峰红移为375 nm，最大荧光峰红移为515 nm。溶剂极性对L1的荧光寿命也有显著的影响。图2B为L1在3种不同溶剂时515 nm处荧光强度随时间衰减的变化曲线。可见，随着溶剂极性的减小(H2O，DMSO，C6H12)， L1在515 nm处荧光强度随时间衰减明显变慢。按照按照(1)式非线性拟合所得衰减参数列于表1。表明水溶液中L1主要为酮式构型。

图3　L1和Cu(Ⅱ)-L1的紫外-可见吸收光谱和荧光谱及Cu(Ⅱ)滴定L1的紫外差光谱Fig.3　UV-Vis and fluorescence spectra of L1 and complex of Cu(Ⅱ)-L1 and UV-Vis difference spectra produced from the addition of Cu(Ⅱ)to L1 in pH value of 7.4,50 mmol·L-1Tris-HCl,20℃;CL1was 10 μmol·L-1

2.1.3L1与Cu(Ⅱ)的结合

无论L1为酮式或烯醇式构型，均可与Cu(Ⅱ)结合形成配合物。在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液中，L1及加入等量Cu(Ⅱ)后的紫外-可见光谱、荧光光谱分别如图3A和图3B所示。由图3A可见，Cu(Ⅱ)与L1的结合使其紫外-可见最大吸收峰由375 nm红移为430 nm，400 nm处出现等吸收点，同时在710 nm处(图3A插图)出现Cu(Ⅱ)的d-d跃迁吸收峰。与图1A对比可见，在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液中，加入等量Cu(Ⅱ)后的紫外-可见吸收光谱类似于L1在pH值为11.0时的吸收光谱，即Cu(Ⅱ)使L1由酮式转化为烯醇式构型。水合Cu(Ⅱ)的最大吸收峰出现在900 nm处[9]，在L1存在下Cu(Ⅱ)的d-d跃迁吸收峰红移为710 nm。表明L1与Cu(Ⅱ)的结合改变了Cu(Ⅱ)的配位场。与紫外-可见吸收光谱一致，加入等量Cu(Ⅱ)后使L1在515 nm处的荧光完全淬灭(图3B)也证明Cu(Ⅱ)可与L1结合形成稳定的配合物。

图3C是在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲条件下，以L1为空白逐渐滴加Cu(Ⅱ)所测得的紫外-可见吸收差光谱。可见，随着Cu(Ⅱ)的滴加在375 nm附近出现负峰、430 nm附近出现正峰并逐渐增强、400 nm处出现等吸收点。当滴加的Cu(Ⅱ)达到一定量后，差光谱不再随着Cu(Ⅱ)的滴加而变化。将420 nm处的表观摩尔吸光度对CCu(Ⅱ)/CL1作图如图3C插图。可见，随着CCu(Ⅱ)/CL1的增加，420 nm处的表观摩尔吸光度线性地增加并在CCu(Ⅱ)/CL1=1.0附近出现明显的拐点。表明Cu(Ⅱ)与L1结合形成1∶1配合物，配合物Cu(Ⅱ)-L1的条件稳定常数为K(Cu(Ⅱ)-L1)= (3.32±0.11)×106mol-1·L。

2.2配体L1及配合物Cu(Ⅱ)-L1与apoCopC的结合

2.2.1L1与apoCopC的结合

图4A是在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲条件下，用L1滴定apoCopC所测得的荧光光谱。可见，apoCopC在320 nm处出现最大荧光峰，随着L1的滴加320 nm处的荧光强度逐渐减小、510 nm处L1的荧光强度逐渐增大。将320 nm处的荧光淬灭ΔF(F0-F)对CL1/CCopC作图如图4A插图。即在CL1/ CCopC<1.0范围，ΔF随着CL1/CCopC的增加而线性增加；当CL1/CCopC>1.0时，ΔF不再随着CL1/CCopC的增加而变化。表明在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲条件下L1可与apoCopC结合形成1∶1的复合物。复合物的形成使apoCopC在320 nm处的荧光淬灭近30%，L1的最大荧光峰紫移5 nm，强度比在pH= 7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液中的强度有所降低，即与apoCopC结合后的L1环境的极性有所降低。

apoCopC存在下L1的荧光寿命列于表1。可见，apoCopC使L1长寿命发光体对衰减的贡献增大，L1环境的疏水性增加。

根据文献方法[10]，按照(2)式将lg[(F0-F)/(F-F∞)]对lgCL1作图，由直线的斜率可得结合位点数约为1.0，由直线的截距可得L1与apoCopC结合的条件稳定常数。不同温度下L1与apoCopC结合的条件稳定常数列于表2中。

其中K为L1与apoCopC结合的条件稳定常数，n为apoCopC的L1结合位点数，F0为没有L1时的荧光强度，F为滴加L1后的荧光强度，F∞为L1最大淬灭时apoCopC的荧光强度。

图4　L1(A)及Cu(Ⅱ)-L1(B)分别滴定apoCopC的荧光光谱Fig.4　Fluorescence spectra produced from the addition of L1(A)and Cu(Ⅱ)-L1(B)to apoCopC(1.0 μmol·L-1) in pH=7.4,50 mmol·L-1Tris-HCl,20℃

表2　L1-apoCopC及L1-Cu(Ⅱ)-CopC表观结合常数和热力学参数Table 2 Thermodynamic parameter and apparent binding constants of L1-apoCopC or L1-Cu(Ⅱ)-CopC

按照Vant-Hoff方程：其中ΔG为L1与apoCopC反应的吉布斯自由能，ΔS为反应熵变，ΔH为焓变。将ΔG对T作图，由直线的斜率和截距可得L1与apoCopC反应的ΔH和ΔS(见表2)。由于ΔH<0且ΔH值较小，ΔS>0，可以得出，L1与apoCopC之间的作用主要为疏水和氢键作用[11]。

2.2.2Cu(Ⅱ)-L1与apoCopC的结合

在相同实验条件下用Cu(Ⅱ)-L1滴定apoCopC所测得的荧光光谱如图4B所示。可见，随着Cu(Ⅱ)-L1的滴加apoCopC在320 nm处的荧光强度逐渐减小。将320 nm处的荧光淬灭ΔF(F0-F)对CCu(Ⅱ)-opC作图如图4B插图。即在CCu(Ⅱ)-CopC<1.0范围，ΔF随着CCCopC的增加而线性增加；当CCu(Ⅱ)CopC>1.0时，ΔF随着CC-L1/CCopC的增加而增加变缓。表明在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲条件下Cu(Ⅱ)-L1也可与apoCopC结合形成1:1的复合物，即三元配合物。配合物的形成使apoCopC在320 nm处的荧光淬灭约48%。按照L1滴定apoCopC类似的方法，根据(2)式处理3个不同温度下Cu(Ⅱ)-L1的荧光淬灭数据，可得Cu(Ⅱ)-L1在apoCopC中的结合位点数n也为1.0，条件结合常数一并列于表2中。由表2数据可见，相同条件下Cu(Ⅱ)-L1与apoCopC结合形成的配合物条件结合常数约是L1-apoCopC复合物条件结合常数的2倍。尽管热力学参数ΔH<0且ΔS>0，结合驱动力仍主要为疏水和氢键作用，但ΔH (L1-Cu(Ⅱ)-apoCopC)是L1-apoCopC的1/2，而ΔS(L1-Cu(Ⅱ)-apoCopC)是L1-apoCopC的2倍多。表明L1和Cu(Ⅱ)-L1分别与apoCopC结合时其作用力有一定的差异。

在生理条件下apoCopC与Cu(Ⅱ)结合的条件常数约为(1.80±0.58)×1013mol-1·L，Cu(Ⅱ)的结合使蛋白质的荧光淬灭约67%[12]，而L1与Cu(Ⅱ)结合的条件结合常数仅为(3.32±0.11)×106mol-1·L，Cu(Ⅱ)-L1几乎不发荧光。作为Cu(Ⅱ)的配体，apoCopC可与L1有效竞争Cu(Ⅱ)，即apoCopC与Cu(Ⅱ)-L1中的Cu(Ⅱ)结合并出现游离L1、使L1在510 nm处的荧光恢复。由图4B可见，滴加Cu(Ⅱ)-L1时L1的荧光几乎没有变化。表明溶液中Cu(Ⅱ)既与apoCopC结合，又与L1结合。

2.3L1-Cu(Ⅱ)-CopC三元配合物

图5A是pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲条件下Cu(Ⅱ)滴定L1-apoCopC的荧光光谱。可见，在320 nm和510 nm处分别出现apoCopC和L1的荧光峰。随着Cu(Ⅱ)的滴加，320 nm和510 nm处的荧光均逐渐被淬灭，即Cu(Ⅱ)同时与apoCopC和L1结合。将apoCopC在320 nm处的摩尔荧光淬灭对CCu(Ⅱ) /CapoCopC-L1作图如图5A插图，可见在CCu(Ⅱ)/CC<1.0范围内，荧光淬灭随着CCu(Ⅱ)C-L1的增加而线性增加，当CCu(C-L1>1.0时，荧光淬灭随着CCu(Ⅱ)/pC-L1增加的变化趋缓，即Cu(Ⅱ)与apoCopC-L1中的apoCopC结合形成1∶1配合物，并使蛋白质的荧光淬灭近43%，小于二元体系中Cu(Ⅱ)对apoCopC的荧光淬灭(67%)[12]；L1在510 nm处的摩尔荧光淬灭对CoCopC-L1作图也示于图5A插图中，可见Cu (Ⅱ)与L1的结合使L1的荧光部分淬灭(约40%)，小于二元体系中Cu(Ⅱ)对L1的荧光淬灭(图3B)。表明三元配合物是以Cu(Ⅱ)为中心离子形成的。

图5B是pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲条件下Cu(Ⅱ)滴定高浓度L1-apoCopC的紫外-可见吸收差光谱。可见Cu(Ⅱ)的滴加导致380 nm附近出现负峰、425 nm附近出现正峰并逐渐增强、412 nm处出现等吸收点。与图3C对比可见，apoCopC的存在使Cu(Ⅱ)与L1结合的紫外-可见吸收差光谱明显不同：等吸收点红移约10 nm，380 nm附近负峰强度远大于425 nm附近正峰强度。当滴加的Cu(Ⅱ)的达到一定量后，差光谱不再随着Cu2+的滴加而变化。将380 nm处的吸光度对CCu(Ⅱ)/CL1-apoCopC作图如图5B插图。可见，随着CCu(Ⅱ)/CL1-apoCopC的增加，380 nm处的吸光度在CCu(Ⅱ)/CL1-apoCopC=1.0附近出现明显的拐点。与荧光实验一致，表明Cu(Ⅱ)为三元配合物的中心。

图5　Cu(Ⅱ)滴定L1-CopC(1∶1)的荧光光谱(A)和紫外-可见吸收差光谱(B)Fig.5　Fluorescence(A)and UV-Vis difference spectra(B)of Cu(Ⅱ)titration to L1-CopC(1∶1)in pH=7.4, 50 mmol·L-1Tris-HCl,20℃

2.4L1在apoCopC的结合位点

2.4.1荧光共振能量转移

apoCopC在320 nm处的荧光源于唯一的Trp83残基，按照Förster无辐射共振能量转移(FRET)理论，给体(Trp83)与受体(apoCopC结合的L1)的距离r和临界能量转移距离R0间有(4)式所示关系。

其中E为能量转移效率，F0为apoCopC在320 nm处的荧光强度，F为L1-apoCopC的荧光强度，R0为临界能量转移距离，如(5)式所示。

其中κ2为取向因子，φTrp为给体(Trp83)的量子产率，n为介质的折射指数，J为(6)式所示的光谱重叠积分。

其中F(ν)为波数ν处给体的荧光强度，ε(ν)为受体的摩尔吸光系数。

图6是apoCopC的荧光光谱(a)和受体L1的紫外可见吸收光谱(b)间的重叠，将其按照(6)式在300～500 nm范围计算的光谱重叠积分为1.61×10-15cm3· L·mol-1。根据(5)式及κ2、φTrp、n的取值[6,13]，可得R0为1.65 nm。由(4)式及能量转移效率E=0.32，得出L1的偶极中心与apoCopC中色氨酸残基偶极中心之间的距离r为1.86 nm，即0.5R0≤r≤1.5R0。说明apoCopC中色氨酸残基向结合L1间的无辐射能量转移使蛋白质320 nm处的荧光被淬灭。

图6　apoCopC的荧光光谱(a)和L1的紫外可见吸收光谱(b)Fig.6　Overlap between the fluorescence spectrum(a)of apoCopC and UV-Vis absorption spectrum(b)of L1 at pH=7.4,50 mmol·L-1Tris-HCl

类似地由Cu(Ⅱ)-L1的吸收光谱与apoCopC在300～500 nm范围内的荧光光谱的重叠及(6)式可得配合物与apoCopC的光谱重叠积分J为2.11×10-15cm3·L·mol-1，而R0为1.72 nm，能量转移效率E为0.39，配合物偶极中心与apoCopC中色氨酸残基偶极中心之间的距离r为1.85 nm，即0.5R0≤r≤1.5R0。配合物对apoCopC荧光的淬灭仍源于无辐射能量转移，r值也没有明显的变化。

apoCopC的Trp83位于蛋白质疏水桶中部，与N端Cu(Ⅱ)结合位点相距约1 nm，与C端Cu(Ⅱ)结合位点相距约2 nm[2-3]。由Cu(Ⅱ)滴定L1-apoCopC时同时与L1、apoCopC结合及所测得的r值可推断L1的结合位点位于蛋白质的N端。

2.4.2分子模拟分析

采用分子自动对接软件ArgusLab 4.0.1对apoCopC的L1结合位点及作用模式进行模拟。模拟中选用apoCopC的已知结构(PDB码：1M42)[1]，通过全局搜索得出最低能量-8.18 kJ·mol-1的构象为对接模拟结果，采用PyMOL软件可视化如图7所示。由图7A可见，L1结合在apoCopC的N端，由于与蛋白质的结合使其分子的平面性遭到破坏。若仍将吡啶环看做分子的偶极中心，则83位色氨酸残基偶极中心与L1偶极中心之间的距离r约为1.72 nm，与用FRET方法所测结果(1.85 nm)相近。

图7B是apoCopC的L1结合位点处的一些氨基酸残基。可见，apoCopC直接参与Cu(Ⅱ)配位的His91，Asp89和Glu27残基处于L1结合位点附近，有利于Cu(Ⅱ)为中心离子的三元配合物的形成。L1的-NH与Ser34的-OH间形成中强氢键(N-H…O，0.23 nm)，同时吡啶环上的N与Ser34的肽键氮形成弱氢键(N-H…N，0.33 nm)；而Phe33的肽键氧与L1的另一-NH间形成中强氢键(O…H-N，0.22 nm)，Gln32的-NH与L1的羰基形成中强氢键(O…H-N，0.20 nm)。此外，结合位点处有许多疏水性氨基酸残基Val30，Phe33，Val57，Val67，Ala36及Pro92等。

图7　L1与apoCopC作用的分子模拟图Fig.7　Molecular docking for the interaction between L1 and apoCopC

综上所述，在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲条件下，L1、Cu(Ⅱ)和apoCopC可形成L1-Cu(Ⅱ)-apoCopC三元配合物，L1与apoCopC的结合导致Cu(Ⅱ)-CopC配合物的一些性质(如Cu(Ⅱ)配位数、Cu (Ⅱ)与蛋白质的结合能力、结合Cu(Ⅱ)的还原性等)改变。与L1不同，尽管水杨醛半卡巴腙(HSSC，Salicylaldehyde semicarbazone)也可与Cu(Ⅱ)结合形成稳定配合物,但由于其结合位点位于蛋白质的C端,HSSC与apoCopC结合后并不影响apoCopC的Cu(Ⅱ)结合性质，只有apoCopC的Cu(Ⅱ)结合位点完全饱和后才与HSSC结合[6]。因此，使用L1为apoCopC的N端Cu(Ⅱ)结合位点扰动分子、HSSC为C端Cu(Ⅱ)结合位点扰动分子有利于CopC铜调控机理的深入研究。

3　结论

在合成、表征2，6-吡啶二甲酰肼-2-羟基萘甲酰腙(L1)的基础上，利用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、荧光寿命测定、分子对接等方法研究了溶液中L1的互变异构、与Cu(Ⅱ)及apoCopC的结合形成二元配合物的性质。通过Cu(Ⅱ)-L1对apoCopC的荧光滴定及Cu(Ⅱ)对L1-apoCopC的紫外-可见吸收光谱、荧光光谱滴定证实：在pH=7.4、50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲条件下，L1、Cu(Ⅱ)、apoCopC可形成以Cu(Ⅱ)为中心的三元配合物。

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[13]Zheng X Y,Pang E G,Li H Q,et al.Chin.Sci.Bull., 2007,52:743-747

Spectral Studies on Complex of 2,6-Pyridine Diformylhydrazine 2-Hydroxylnaphthene Carboxylic Hydrazone-Cu(Ⅱ)-CopC

REN Xiao-LinSONG ZhenYANG Bin-Sheng＊
(Institute of Molecular Science,Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering
of Education Ministry,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

2,6-Pyridine diformylhydrazine 2-hydroxylnaphthene carboxylic hydrazone(L1)was synthesized by acylation,esterification and aminolysis reaction.The effect of pH value on isomerization of L1 and the binding among L1,Cu(Ⅱ)and copper trafficking protein,apoCopC,were studied by using UV-Vis absorption,fluorescence spectra and fluorescence lifetime measurement.The results show that the binding constant is 3.32×106mol-1·L for Cu(Ⅱ)-L1,4.01×105mol-1·L for L1-apoCopC,separately,in pH value of 7.4,50 mmol·L-1Tris-HCl. Meanwhile,the binding constant between Cu(Ⅱ)-L1 and apoCopC is 8.09×105mol-1·L.The average distance between the bound L1 and Trp83 of apoCopC from fluorescence resonance energy transfer was determined and the binding site of L1 in apoCopC,which locats at N-terminal,was shown by an automated public domain software package ArgusLab 4.0.1.The formation of a ternary complex,L1-Cu(Ⅱ)-CopC,is confirmed by the titration of Cu(Ⅱ)to L1-apoCopC in pH value of 7.4 and 50 mmol·L-1Tris-HCl.

2,6-pyridine diformylhydrazine 2-hydroxylnaphthene carboxylic hydrazone;copper(Ⅱ);copper trafficking protein;complex;spectra

O614.121；O614.4

A

1001-4861(2015)09-1811-09

10.11862/CJIC.2015.244

2015-05-25。收修改稿日期：2015-07-17。

国家自然科学基金(No.20771068，20901048)和高等学校博士学科点专项科研基金(No.20131401110011)资助项目。

＊通讯联系人。E-mail：yangbs@sxu.edu.cn，Tel：0351-7016358