刘璇 ，杨益，李瑾慧，孙走南，唐玥，苏文莉，刘京梅，于雅琴，常国辉

1.吉林大学 公共卫生学院，吉林 长春 130021；2.军事医学科学院 疾病预防控制所，北京 100071

植物多酚是一类种类繁多的高分子多元酚化合物，为植物的次级代谢产物，广泛存在于植物体的叶、果肉及树皮中，包括药材、粮食、水果和蔬菜等，并且有很强的生物学活性，能与蛋白质、核酸和金属离子等相互作用[1-3]。单宁酸（tannic acid）是简单的水解类植物多酚，其抗肿瘤、抗氧化及抗感染等特性已多有报道[4]。近年来，单宁酸作为广谱低毒的病毒抑制剂而备受研究者关注[5]。单宁酸的生物学效应可能与其和细胞膜相互作用的能力密切相关[6]。膜荧光各向异性和跨膜电位是细胞膜的重要生物物理学特性，有研究表明，病毒侵入可改变宿主细胞膜的流动性和膜电位[7-8]。因此，我们以痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）WR（Western Reserve）株为研究对象，测定病毒感染对细胞膜流动性和膜电位的影响及单宁酸的干预作用，为揭示单宁酸抑制病毒感染的作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Vero E6 细胞由本实验室细胞库保存；VACV WR株由英国布里斯托大学Siddell教授惠赠。

胎牛血清（Sigma，美国）；DMEM、胰蛋白酶（Gibco，美国）；荧光探针DPH（用四氢呋喃配成2.0×10-3mol/L 母液，避光保存于-20℃，临用前用PBS 稀释）（Aldrich，美国）；荧光探针DiBAC4（3）（用无水乙醇配成1 mg/mL 母液，避光保存于-20℃，临用前用PBS 稀释）（Molecular Probe，美国）；单宁酸（浙江省温州市瓯海精细化工有限公司）；中性红（国药集团化学试剂有限公司）；SpectraMax M5 多功能酶标仪（美谷分子仪器公司，美国）；FACSCalibur 流式细胞仪（BD公司，美国）。

1.2 实验分组

实验分为正常对照组、病毒组、单宁酸组、病毒加单宁酸组（病毒+单宁酸组）。病毒+单宁酸组分为先加入单宁酸后感染病毒（吸附前组）、先感染病毒后加入单宁酸（吸附后组）和感染病毒的同时加入单宁酸（吸附同时组）。

1.3 单宁酸细胞毒性测定

取对数生长期的Vero E6 细胞，按8×104/mL 浓度每孔200 μL接种于96孔板，37℃、5% CO2培养箱中培养，待长成单层细胞后，移去培养液上清，分别加入浓度为1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL 的含单宁酸维持液，每孔100 μL；培养24 h 后，采用中性红比色法，在酶标仪上测定D492nm值，按下式计算细胞存活率，以Probit 回归方法计算单宁酸半数中毒浓度（TC50）。各组均设4个复孔，实验重复3次。

细胞存活率（%）=（试验孔D492nm/对照孔D492nm）×100%

1.4 单宁酸抑制VACV活性测定

制备已长满单层的96孔细胞培养板，使用单宁酸1～16 μg/mL，分别于病毒吸附前、吸附后及吸附同时干扰病毒感染细胞：①吸附前：单宁酸溶液100 μL/孔孵育1 h，弃液，PBS 洗涤，100 TCID50病毒液100 μL/孔吸附1 h；②吸附后：100 TCID50病毒液100 μL/孔吸附1 h，弃液，PBS 洗涤，加单宁酸溶液100 μL/孔孵育1 h；③吸附同时：将等体积的100 TCID50病毒液与单宁酸溶液混合后，于细胞培养板加混合液100 μL/孔，37℃孵育1 h。

将上述处理的细胞培养板内液体吸弃，PBS 洗涤后加入维持培养基。设正常细胞对照孔和病毒对照孔，每天于倒置显微镜下观察细胞变化。置37℃、5% CO2培养箱中培养72 h 后，用中性红比色法检测。各组均设4个复孔，实验重复3次。

以Probit 回归方法计算半数抑制浓度（IC50）；按下式计算病毒抑制率：

病毒抑制率（%）=（药物处理组D492nm-病毒对照组D492nm）/（细胞对照组D492nm-病毒对照组D492nm）×100%

按下式计算治疗指数（TI）：

1.5 荧光偏振法测定细胞膜流动性

在Vero E6 细胞（密度为2×106/mL）中加入100 TCID50的病毒液或16 μg/mL 单宁酸溶液进行孵育。正常对照组加入1 mL细胞维持液，病毒组加入1 mL病毒液，单宁酸组加入1 mL单宁酸溶液，吸附同时组加入1 mL病毒和单宁酸的等体积混合液，以上各组均于37℃孵育1 h。吸附前组先加1 mL 单宁酸溶液，37℃孵育1 h，PBS离洗后再加1 mL病毒液，37℃孵育1 h；吸附后组先加1 mL 病毒液，37℃孵育1 h，PBS洗涤后再加1 mL单宁酸溶液，37℃孵育1 h；孵育时须每15 min摇动混匀一次。

上述各组细胞悬液于1000 r/min离心5 min，弃上清，加入2×10-6μmol/mL DPH 荧光探针溶液1 mL，37℃孵育并不断振荡30 min，再用PBS 液洗一次，于激发波长365 nm、发射波长430 nm测定荧光各向异性（r）。r值越大，表示细胞膜流动性越小；反之，流动性越大。

1.6 流式细胞术测定细胞膜电位

细胞处理同1.5，细胞悬液1000 r/min 离心5 min，弃上清，加入0.1 μg/mL DiBAC4（3）荧光探针溶液1 mL，37℃孵育30 min 后上机测定，用未经荧光物质孵育的Vero E6 细胞调零。荧光增强，表示细胞膜电位绝对值减小，出现去极化变化；反之，荧光减弱，细胞膜电位绝对值增大，出现超极化变化。

1.7 统计学分析

应用SPSS17.0 统计软件对结果进行分析，实验数据以x±s表示。组间比较采用方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 单宁酸对Vero E6细胞的毒性作用

单宁酸对Vero E6细胞的毒性作用表现为细胞增殖缓慢、颗粒较多、折光性强。单宁酸对细胞的毒性作用随着浓度的降低而逐渐减弱。中性红比色法测得单宁酸TC50为81.0 μg/mL，TC0为16.0 μg/mL。

2.2 单宁酸抑制VACV感染效果

实验结果见图1，单宁酸对病毒的抑制作用随着浓度的增加而增强。病毒吸附后加入单宁酸，病毒抑制率为18.7%～69.3%（IC50为8.7 μg/mL，TI 为9.3）；病毒吸附同时加入单宁酸，病毒抑制率为11.7%～60.0%（IC50为13.1 μg/mL，TI为6.2）。

2.3 单宁酸对VACV 感染后细胞膜流动性变化的干预作用

VACV感染后宿主细胞膜荧光各向异性显著低于正常细胞对照组（P＜0.05），说明病毒感染后宿主细胞膜流动性升高。单宁酸处理Vero E6细胞后荧光各向异性与正常对照组接近，说明单宁酸对正常细胞膜流动性无明显影响。3 种加入方式中，单宁酸在病毒吸附前和病毒吸附后作用，均可使荧光各向异性升高，其中吸附后组与正常对照组比较有显著性差异（P＜0.01），说明单宁酸在VACV 吸附后作用可降低宿主细胞膜流动性（表1）。

2.4 单宁酸对VACV 感染后细胞膜电位变化的干预作用

VACV感染Vero E6细胞后，荧光强度显著低于正常细胞对照组（P＜0.01），说明病毒感染后宿主细胞膜处于超极化状态。单宁酸作用于Vero E6细胞后，荧光强度显著低于正常细胞对照组（P＜0.01），说明单宁酸作用同样使细胞膜处于超极化状态。单宁酸3种处理方式下，VACV吸附各组的荧光强度值与病毒对照组比较无显著性差异，说明单宁酸不同处理方式对VACV感染各组中膜电位的变化无明显干预作用（表2）。

3 讨论

单宁酸是相对分子质量为500～3000 的天然酚类化合物，在自然界分布广泛，因其具有多酚羟基结构而表现出独特的化学特性和生理活性。VACV是只在靶细胞的胞浆中复制的双链DNA（dsDNA）病毒。成熟的病毒粒子呈椭圆形或砖形，外层有较厚的囊膜包裹，其囊膜含有多种病毒蛋白。病毒感染和复制的过程包括3个步骤：①病毒的吸附、侵入和脱壳；②基因组的转录和复制；③病毒的组装、成熟和释放。本实验中，单宁酸以不同加入方式干扰病毒感染细胞，结果显示，单宁酸以病毒吸附后及病毒吸附同时2种方式加入时，可有效抑制VACV 感染，于吸附前孵育细胞对VACV 侵入细胞无阻断作用，提示单宁酸抑制VACV感染的机制可能存在于病毒吸附同时和吸附后。

图1 单宁酸不同加入方式抑制VACV感染效果（，n=3）

病毒的感染首先依赖于病毒吸附蛋白对细胞表面受体的吸附，随后发生的侵入也同病毒感染成功与否密切相关，这些环节均涉及病毒与细胞膜的相互作用。细胞膜脂质和脂蛋白质都有一定的流动性，细胞膜流动性的改变可影响病毒吸附和侵入细胞[9-10]。如吩噻嗪通过增强细胞膜流动性从而达到抑制丙型肝炎病毒（HCV）与细胞膜融合的效果[11]；而Harada 等发现，在病毒吸附同时和吸附后2 个阶段，细胞膜流动性的升高都可以增加人免疫缺陷病毒（HIV）感染率[12]。有研究表明，植物多酚可嵌入细胞脂质双层膜的表层，影响细胞膜生物学特性[13]。本研究结果显示，单宁酸对正常细胞膜流动性无明显影响，而VACV 感染后宿主细胞膜流动性显著升高。3 种不同加入方式中，只有在感染后加入单宁酸，可以干预病毒感染对细胞膜的影响，细胞膜流动性显著低于正常对照组。提示单宁酸抑制病毒感染可能存在以下机制：VACV 感染后细胞膜流动性的增加易于单宁酸嵌入脂质双层膜，致使细胞膜流动性显著降低，膜流动性的降低干扰了VACV 入胞过程，从而抑制病毒感染。

细胞膜是病毒侵入细胞的第一道重要防线，膜电位是细胞膜重要的生物物理特性。从病毒吸附蛋白与细胞受体特异性结合到内吞入胞，病毒侵入细胞是一个能量依赖的过程。研究表明，脊髓灰质炎病毒和人鼻病毒侵入宿主细胞过程涉及细胞膜电位变化，细胞膜跨膜电位差是促使病毒内化的能态之一[14-15]。本实验结果表明，VACV 感染Vero E6 细胞后，可使细胞膜发生超极化，形成局部电流，跨膜电位差利于病毒穿入靶细胞内。单宁酸亦使细胞膜处于超极化状态，并不能有效降低病毒感染引起的细胞超极化现象，说明对病毒借助跨膜电位差进入宿主细胞这一过程无显著干预作用，由此我们推测单宁酸抑制病毒感染的作用机制可能与此环节无关。

表1 单宁酸对VACV感染后细胞膜流动性变化的干预作用（，n=3）

表1 单宁酸对VACV感染后细胞膜流动性变化的干预作用（，n=3）

与正常对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

表2 单宁酸对VACV感染后细胞膜电位变化的干预作用（，n=3）

表2 单宁酸对VACV感染后细胞膜电位变化的干预作用（，n=3）

与正常对照组比较，aP＜0.01

综上所述，单宁酸在体外有较强的抑制痘苗病毒感染的作用，其作用机制可能与干预细胞膜流动性有关，具体作用靶点还有待进一步研究。

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